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目的:超临界大面积或大段骨缺损仍旧是临床面临的治疗难题。由于自体骨移植和异体骨移植所存在的局限性[1],学者们致力于研发人工骨材料,但为了解决人工骨材料成骨效应不良的问题,人们关注到了物理治疗方法与人工骨材料联合治疗的新方案。低强度脉冲超声波（low-intensity pulsed ultrasound stimulation,LIPUS）是近年来比较被认可的促进骨愈合修复的一种物理治疗方法。由于LIPUS在骨愈合方面的促进作用,及其对三维多孔材料内物质交换的促进作用。近年来,研究的主要目的是将LIPUS作为辅助手段与人工骨材料联合,应用于骨缺损修复的研究,为大面积骨缺损的修复提供一个新的思路。而LIPUS对于三维多孔材料内成骨效应影响的适宜参数（包括强度、频率、时间等）的研究罕有报道。有研究证实LIPUS对成骨细胞影响的调控机制是通过调节整合素α5β1/PI3K/Akt通路,ROCK-Cot/Tpl2-MEK信号通路,m-TOR通路发挥作用。以上机制的研究均基于二维平面模型上,而基于二维平面阐述的机制不能完全用于解释三维多孔材料上的实验结果。所以探索LIPUS对三维多孔材料成骨作用影响的机理就非常有必要。近年来,研究证实多种miRNA能够参与成骨细胞的分化过程,而miRNA与LIPUS对多孔材料成骨作用影响的关系还未见报道。所以在本研究中,1、通过对两种频率LIPUS进行体外实验对比,观察两种频率的LIPUS对多孔材料上的成骨细胞的增殖和分化的影响,筛选优势频率,为LIPUS促进多孔材料修复骨缺损的体外研究提供数据。2、通过体内实验比较两种频率LIPUS对多孔材料修复兔下颌骨骨缺损修复的影响,筛选优势频率,为探讨LIPUS促进三维多孔材料修复骨缺损的体外研究提供数据。3、通过检测mi RNA在LIPUS刺激下三维培养成骨细胞中的差异表达谱,初步探索miRNA在LIPUS刺激下三维多孔材料上成骨细胞内的变化情况,为探讨LIPUS促进三维多孔材料内成骨效应的机制研究提供分子生物学数据。研究方法:1、将多孔钛合金材料随机分为高频超声组、低频超声组和对照组。在材料上进行小鼠前成骨细胞（mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1）的接种和培养,利用扫描电子显微镜（scaning electron microscope,SEM）评价两种频率LIPUS作用下多孔材料上成骨细胞的黏附状态。采用CCK-8（cell counting kit-8,CCK-8）和流式细胞仪PI染色检测两种频率LIPUS对材料上成骨细胞增殖的影响。采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatese,ALP）和骨钙素（osteocalcin,OCN）检测技术测定两种频率LIPUS对多孔钛合金材料上成骨细胞早、晚期分化的影响。2、将多孔钛合金材料植入兔下颌骨的骨缺损区,随机分为高频超声组、低频超声组和对照组,加载3周和6周后取材进行X线影像学观察有无感染,Micro-CT扫描观察不同组材料内新骨形成的情况;制作硬组织切磨片,通过荧光显微镜观察各组多孔钛合金材料内新骨生成的活跃程度;对组织切片进行甲苯胺蓝染色、亚甲基蓝-酸性品红染色和von Kossa银染分析不同组多孔材料内新成骨情况和骨矿化情况。3、将多孔钛合金材料与小鼠前成骨细胞复合培养后,随机分为超声组和对照组,加载7d后,应用高通量miRNA测序技术检测在LIPUS作用下三维培养成骨细胞中miRNA的差异表达谱,并通过生物信息学分析对差异表达的miRNA进行靶基因的预测,GO和KEGG Pathway功能聚类分析。再通过real-time PCR验证测序结果的可靠性。结果:1、SEM观察各组多孔钛合金材料上MC3T3-E1细胞均伸展良好,可见伪足伸出,细胞间靠伪足相互连接,边界模糊,并可见细胞长入材料空隙内部,但各组间细胞的密度及形态无明显区别。CCK-8结果显示细胞数量均随着时间的延长而增多,但三组之间的OD值无统计学差异。流式PI染色3d后细胞增殖指数三组之间都没有统计学差异。ALP结果显示细胞的ALP活性均随时间的延长而增高,在4,7,10d两种频率超声组与对照组相比差异具有统计学意义,而两种频率之间没有统计学差异。OCN含量检测,细胞的OCN含量均随时间的延长而增高,在10,14d两种频率超声组与对照组相比差异具有统计学意义,而两种频率之间没有统计学差异。2、X线影像学观察三组在两个时间点均未发现感染迹象,骨与材料结合紧密。Micro-CT扫描结果显示随着时间的推移,多孔钛合金内新生骨量逐渐增大,相同时间点两频率组的新骨形成量优于对照组,但两频率组之间无明显差异。荧光显微镜观察随着时间的延长,多孔钛合金内荧光带宽度和荧光强度逐渐下降,但是荧光分布面积逐渐扩大。相同时间点两频率组的荧光带宽度,荧光强度,荧光分布面积优于对照组,但两频率组之间无明显差异。甲苯胺蓝染色、亚甲基蓝-酸性品红染色结果均是随着时间的延长,多孔钛合金内成骨面积越来越大,骨组织结构越来越成熟,相同时间点两频率组的新骨形成面积和骨成熟度优于对照组,而两频率组之间没有明显统计学差异。von Kossa银染结果,随着时间的增加,多孔材料内矿物质沉积的面积和密度均逐渐增大。相同时间点两频率组的矿物质沉积的量优于对照组,而两频率组之间无明显统计学差异。3、LIPUS可以下调多孔钛合金材料上成骨细胞内miRNA的表达量,下调的miRNA有30个。对30个表达下调的miRNA进行靶基因预测,并对预测到的靶基因进行了GO和KEGG富集分析,得到599条GO terms富集,185条信号通路。real-time PCR验证4个miRNA表达情况,结果与测序结果一致,表明测序结果真实可靠。结论:1、两种频率LIPUS对多孔钛合金材料上成骨细胞的增殖没有明显影响,可以明显促进材料上细胞的分化,两种频率之间没有明显差异。2、两种频率LPIUS可以明显促进多孔钛合金材料修复兔下颌骨骨缺损的新骨形成,但两种频率之间没有明显差异。3、LIPUS可以下调多孔钛合金材料上成骨细胞内30个mi RNA的表达。