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番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染在临床上以肝脏和脾脏出现白色坏死点为特征,临床发病率和死亡率都很高,它能导致免疫抑制,给番鸭养殖业带来了巨大经济损失,然而目前对于番鸭呼肠孤病毒感染,缺乏有效的治疗药物。中药多糖具有抗病毒、增强免疫力等生物学功能,并且具有低毒性,低耐药等特点,对于番鸭呼肠孤病毒的防治表现出了巨大的潜力。本试验选用黄芪多糖(APS)分别进行了体外、体内抗病毒作用研究及免疫试验,初步揭示了黄芪多糖的抗病毒机理,结果表明黄芪多糖预防用药能延迟番鸭呼肠孤病毒感染番鸭出现症状的时间,减轻其引起的病理变化,显著降低死亡率,为临床应用提供了一定的理论依据。主要研究结果如下:试验一、黄芪多糖、猴头菇多糖、“芪苓散”超微粉用药浓度的筛选将1日龄雏番鸭165羽随机分成11组,每组15羽,分别为空白对照组,同居感染对照组,黄芪多糖低、中、高剂量预防组,猴头菇多糖低、中、高剂量预防组,“芪苍散”超微粉低、中、高剂量预防组。从1日龄开始,黄芪多糖和猴头菇多糖低、中、高剂量预防组分别以浓度O.1g/L、0.2g/L、0.4g/L饮水给药;“芪苓散”超微粉低、中、高剂量预防组分别以浓度2.5g/kg、5g/kg、10g/kg拌料给药;5日龄时用建立的同居感染模型进行同居感染,试验周期为25d。结果表明添加中药各预防组的同居感染番鸭的死亡率均显著降低,其中同居感染对照组死亡率53.30%,黄芪多糖高剂量预防组的死亡率为6.67%,猴头菇多糖中剂量预防组未见死亡,“芪苓散”超微粉中剂量预防组的死亡率为13.30%。同居感染对照组的同居感染番鸭出现临床症状的时间为6日龄,黄芪多糖高剂量预防组、猴头菇中剂量预防组、“芪苓散”超微粉中剂量预防组的同居感染番鸭出现临床症状的时间比同居感染对照组有所延迟,分别为10日龄、8日龄、8日龄。各用药组番鸭体重与同居感染对照组的体重差异均不显著。研究结果显示黄芪多糖(APS)以0.4g/L浓度自由饮水对MDRV感染的番鸭防治效果较好。试验二、黄芪多糖用药时间和疗程确定 将1日龄雏番鸭165羽随机分成11组,每组15羽,分别为空白对照组、同居感染对照组、1日龄开始用药3组、同居感染当天开始用药3组、同居感染番鸭出现症状开始用药3组,每个用药时间分为用药1周、用药2周、全程用药三个疗程,分别在饮水中添加0.4g/L黄蔑多糖。研究结果显示1日龄开始用药的同居感染番鸭出现临床症状的时间比同居感染当天开始用药和同居感染番鸭出现症状的时间晚。从1日龄开始全程用药组的番鸭死亡率为6.67%,显著低于同居感染对照组的死亡率26.67%。结果表明1日龄开始全程用药能推迟MDRV感染番鸭出现临床症状的时间,并且能显著降低MDRV感染番鸭的死亡率。试验三、黄芪多糖对MDRV感染番鸭血清细胞因子、神经介质和激素的影响 将1日龄雏番鸭分成空白组(BCG)、黄芪多糖对照组(ACG)、同居感染对照组(CICG)、黄芪多糖预防组(APG),每组3个重复,用建立的自然感染发病模型进行试验,分别在同居感染前、同居感染后3d、9d、17d采取血清并剖检观察病变。用ELISA方法检测实验番鸭血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、GC、GH、β-EP含量。研究结果表明:(1)临床剖检发现,在同居感染早期使用黄芪多糖能延迟同居感染番鸭出现病理变化的时间;在同居感染中期使用黄芪多糖能减轻番鸭感染MDRV后引起的病理变化;在同居感染后期,各试验组感染MDRV番鸭的病理变化均有减轻趋势。(2)番鸭呼肠孤病毒在感染前期对番鸭血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、GC、GH、β-EP的含量无显著影响,在感染中期能影响机体IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α的分泌,抑制机体IL-4的分泌,在感染后期抑制机体分泌GH,在整个感染过程中能促进机体β-EP的分泌。(3)空白对照组、黄芪多糖对照组、黄芪多糖预防组这3组番鸭血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、GC、GH、β-EP含量在同居感染前,同居感染后3d、9d、17d均无显著差异,表明黄芪多糖对机体的免疫具有双向调节作用,黄芪多糖不仅能维持MDRV感染的雏番鸭血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、GC、GH、β-EP含量处于动态平衡,也能使健康雏番鸭血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、GC、GH、β-EP含量处于动态平衡。试验四、黄芪多糖在体外对番鸭呼肠孤病毒感染的影响研究 在黄芪多糖安全浓度范围内,设置了高中低(1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL)三种剂量黄芪多糖,设计了黄芪多糖先于MDRV加入CEF(鸡胚成纤维细胞)、黄芪多糖与MDRV同时加入CEF、CEF先接种MDRV后加入黄芪多糖这3种加药方式,观察细胞病变,计算TCID50以评价黄芪多糖对MDRV感染细胞能力的影响。1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL 黄芪多糖先于 MDRV 加入 CEF,分别使 MDRV 的 TCID50从10-4.12/0.1mL降为10-225/0.1mL、10-2.88/0.1mL、10-3.15/0.1mL。1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL黄芪多糖与MDRV同时加入CEF或CEF先接种MDRV后加入1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL黄芪多糖这两种加药方式对MDRV的TCID50几乎没有影响。研究结果表明:在安全浓度范围内,黄芪多糖仅先于病毒之前加入时对MDRV-YB4有抑制作用,且有一定的量效关系,提示临床用药以预防用药效果最好。试验五、黄芪多糖临床应用试验 1日龄番鸭随机分成空白对照组(BCG),黄芪多糖用药疗程2周组(ACG-2),黄芪多糖用药疗程3周组(ACG-3),黄芪多糖用药疗程6周组(ACG-6)。ACG-2、ACG-3、ACG-6组番鸭从1日龄开始在饮水中添加黄芪多糖,浓度为0.4g/L,每日记录饲料消耗和死亡情况,分别在14、21、28、35、42日龄时称量体重,并在42日龄时每组随机采血分离血清用于检测血清中 IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、GC、GH、β-EP 含量。研究结果显示黄芪多糖用药2周、用药3周和用药6周均对42日龄番鸭的料重比和体重无明显影响,但黄芪多糖用药3周组、黄芪多糖用药6周组番鸭的成活率100.00%比空白对照组和黄芪多糖用药2周组的成活率97.50%提高了 2.50%。在42日龄时,黄芪多糖用药疗程2周、3周、6周组的番鸭血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、GH的含量与空白对照组相比均无显著差异,进一步验证了使用黄芪多糖能维持健康雏番鸭群血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、GC、GH、β-EP的含量处于动态平衡。