论文部分内容阅读
背景:类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是受到遗传、激素和环境等因素共同影响而引发的一种缓慢发展、关节不断受到损害最终导致自主功能困难为主的自身免疫性疾病。RA会引起患者的关节组织发炎,骨骼形态异常,使其无法正常活动。在最近的临床试验中,已证明选择性RA特异性类风湿因子与抗环瓜氨酸肽抗体之间存在相关性,两者的存在相互影响会使RA患者的临床症状持续加重。在中国,已建立的RA模型的主要目标组织是软骨和滑膜组织,其病理特征是内膜增生和滑膜下层炎性细胞蓄积。目前对RA患者进行控制病症和组织炎症,维持关节功能,避免关节畸形为主。氧化应激,常见于慢性疾病的初始阶段。正常人体内存在机体氧化的产生与抵抗的平衡,而RA患者这种机体内的氧化与抗氧化平衡出现了紊乱。持续的炎症损伤、长期的药物治疗、疼痛和功能活动受限,导致患者机体处于氧化应激状态,表现为活性氧（reactive oxygen species,ROS）的过量产生而抵抗氧化的能力不足,会损坏关节滑膜组织产生的蛋白质、脂质、核酸和其他基质成分,打破了原有的氧化与抗氧化均衡,从而引发氧化应激反应,并会直接导致机体局部组织出现缺氧状态。正常生理情况下,当ROS以低浓度存在时,它可用作细胞中的“氧化还原转运蛋白”,以发挥其细胞信号转导和功能调节的职能。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）,谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）等的产生有利于细胞内进行氧化抗争。氧化应激的关键转录因子NF-E2相关因子2（NF-E2-related factor 2,Nrf2）可以激活Ⅱ相解毒酶,并促使Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-related protein 1,Keap1）脱偶联,并且将具有活性的Nrf2转运到细胞核中,与Maf蛋白联结后形成不同类型的亚基组成的二聚物,然后与抗氧化剂反应元件（antioxidant responsive element,ARE）结合,进而激活靶基因表达并抑制线粒体和NADPH的合成,进而抑制ROS的产生。类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis,RA-FLSs）具有类肿瘤细胞的特点,即异常增殖引发炎症等打乱机体原本的稳态。而当ROS水平超过一定标准时可能会诱导线粒体通透性的瞬时孔打开,使线粒体受到伤害,影响三磷酸腺苷（adenosine triphophate,ATP）的合成,诱导细胞凋亡。白藜芦醇（resveratrol,Res）是植物抗毒素,具有很多生物活性的多酚类化合物。Res天然存在于顺式和反式异构体中,植物中以反式异构体为主,其生理功能较顺式结构功能应对暴露于紫外线和真菌感染等伤害应激具有显著修复的作用。目的:探讨不同浓度Res通过Nrf2-Keap1通路对过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）处理的RA-FLSs中氧化应激以及凋亡的影响。方法:CCK-8法检测5μM H2O2和不同浓度Res（0、1、10、20、40μM）处理后的RA-FLSs细胞增殖,划痕实验检测RA-FLSs迁移能力。经过上述处理检测RA-FLSs上清中丙二醛（malonaldehyde,MDA）和细胞内ROS的含量;Hoechst33342、流式细胞术检测RA-FLSs凋亡的影响;Western Bloting和免疫荧光检测Nrf2、Keap1、血红素加氧酶1（heme oxygenase1,HO-1）、核心因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）、B淋巴细胞瘤-2（b-cell lymphoma-2,Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（bcl-2-associated X,Bax）蛋白的表达。同时采用慢病毒载体干扰Nrf2后,验证Res是否通过Nrf2-Keap1通路产生影响。选取5μM H2O2和40μM Res处理Nrf2 si RNA感染后RA-FLSs,线粒体染色法（红色荧光）检测其中的线粒体ROS含量;流式细胞术检测其凋亡情况;Western Blotting检测其中Nrf2、Keap1、HO-1、Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:（1）RA-FLSs经5μM H2O2处理出现异常增殖的现象,Res呈剂量依赖性抑制RA-FLSs的异常增殖和迁移。（2）RA-FLSs经5μM H2O2处理增加了细胞内MDA和ROS水平,Res呈剂量依赖性激活Nrf2核内表达与Keap1脱联,增加HO-1的表达,增加了抗氧化酶的产生以降低RA-FLSs中MDA和ROS水平。（3）Res通过激活Nrf2阻止κB抑制剂蛋白（inhibitors ofκB,IκB）发生磷酸化,进而阻止核因子NF-κB p65亚基（nuclear factor NF-kappa-B p65 subunit,NF-κB p65）的活化,降低Bcl-2的表达,增加Bax的表达,诱导RA-FLSs产生凋亡。这与流式细胞术的分析结果一致,均表明细胞明显趋于凋亡的现象。（4）RA-FLSs经慢病毒感染敲低Nrf2蛋白后,与NC组相比,Res虽能激活Nrf2-Keap1通路,但激活不明显,且Res降低线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species,mt ROS）的能力明显低于慢病毒感染前,表明Nrf2蛋白的缺失影响Res的抗氧化水平。（5）RA-FLSs经慢病毒感染敲低Nrf2蛋白后,40μM Res处理组的Bcl2蛋白表达和Bcl2/Bax比值均低于NC组和5μM H2O2组,表明Nrf2蛋白的缺失影响Res的诱导凋亡的能力,且与流式细胞术的分析结果一致。结论:（1）Res通过Nrf2-Keap1通路,抑制RA-FLSs中ROS及MDA的产生,减轻氧化应激带来的损伤。（2）Res通过激活Nrf2-Keap1通路抑制NF-κB p65的活性,抑制RA-FLSs的异常增殖及迁移,诱导RA-FLSs发生凋亡。（3）慢病毒感染RA-FLSs,降低Nrf2的表达,影响Res的抗氧化和诱导凋亡的能力。