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本试验通过对PRRSV 5 株广东流行株ORF3, 5, 6 3 个基因的分析,探讨广东省5株流行株之间及其与其他毒株间的遗传变异关系,为探索广东省PRRSV 的来源、分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据,同时为研制基因工程疫苗奠定了基础。另外将腺病毒表达系统与PRRSV 的主要抗原多肽的基因有机地结合起来,利用腺病毒对动物体细胞的广泛感染性,改善PRRSV 的GP3、GP5 对动物免疫系统的刺激效率和方式,模拟PRRSV病毒的自然感染过程,以期更好地发挥PRRSV GP3、GP5 的抗原活性,为研制PRRSV高效安全的基因工程疫苗开辟新途径。本试验的主要内容及结果如下: 1.5 株PRRSV GD 株ORF3、ORF5、ORF6 基因的变异分析根据GeneBank 中发表的序列分别设计合成了针对PRRSV ORF3, ORF5 和ORF6 基因的引物,利用RT-PCR 方法从广东省送检的5 份可疑病料中均分别扩增得到大小约787bp、630bp、550bp 的片段,克隆入pMD18-T 载体并测序。应用DNAStar 软件分析所测的序列,与国内外已发表毒株和疫苗株(RespPRRS/Repro、RespPRRS MLV)及LV4.2.1 等毒株的序列进行比较,结果表明:广东省的5 个毒株在遗传关系上接近HB-1(sh)株,本研究中分离于不同猪场的5 个毒株间的核苷酸序列差异不显著,可能有共同的来源。2.PRRSV ORF3-5串联基因重组腺病毒的构建用WP3L和WP3R引物从pT-ORF3阳性质粒上扩增完整的ORF3 片段,利用T-A 连接的原理将片段亚克隆入pMD18-T 载体EcoV 处,按常规方法转化DH5a,筛选出正向重组质粒并测序,命名为pMD-ORF3。用WP5L和WP5R引物从pT-ORF5 阳性质粒上扩增ORF5 基因,用Sph I/Hind III 双酶切后回收目的片段,将重组质粒pMD-ORF3 也经Sph I/Hind III 双酶切并去磷酸化,与目的片段于16℃连接,按常规方法筛选出重组阳性质粒并测序,命名为pMD-ORF3-5。用Not I/HindIII 从重组质粒载体pMD-ORF3-5上切取ORF3-5 基因插入pAdTrack-CMV穿梭载体,挑取卡那霉素(Kan~+)抗性的单菌落,按常规方法获得阳性重组子pAdTrack-CMV-3-5。将构建的携有PRRSV ORF3-5 串联基因的重组穿梭载体Pme I 线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1 共转染E.coli BJ5183,使之同源重组,经PCR、酶切鉴定获得重组腺病毒质粒pAdCMV-3-5,然后用Pac I 线性化,用脂质体介导转染入人