研究背景:　　内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)是细胞内蛋白质合成,蛋白折叠与修饰以及蛋白质的成熟和转运的主要场所.内质网稳态是细胞实现正常功能的基本条件.当细胞在受到多种生理和病理因素,包括营养缺乏、缺氧等影响时会改变内质网蛋白质折叠和修饰功能进而导致大量错误蛋白质(misfolded)和未折叠蛋白质(unfolded)在内质网中不断积累,引起内质网应激(ER stress).内质网应激通过启动一系列适应性机制促进内质网蛋白质稳态和细胞存活,称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR).真核细胞中UPR效应主要通过启动三种激信号调控通路来维持内质网的稳态,通过激活IRE1α促进转录因子XBP1调控下游关于蛋白质折叠、蛋白质转运和分泌相关基因表达,增加对蛋白质的修饰和处理过程;通过激活PERK促进磷酸化eIF2α,抑制蛋白质合成相关基因表达,减少蛋白质的生成;通过激活ATF6转移到高尔基复合体,调控内质网蛋白质降解(ERAD)相关基因表达,增加对错误蛋白质的降解过程.在肿瘤组织中,快速生长的肿瘤细胞通常处于缺血缺氧和营养缺乏的压力性细胞微环境中,内质网应激作为一种适应性机制在肿瘤细胞中通常处于较高水平的状态.同时,许多研究表明活化的UPR调控通路及相关信号分子是细胞恶性转换和肿瘤生长转移的重要机制,UPR信号分子可以通过调控肿瘤相关基因和抑癌基因相互作用对肿瘤发生、发展和细胞耐药发挥重要调控作用.此外,除了在调控肿瘤内蛋白质稳态和促进细胞存活作用以外,持续激活的内质网应激可以通过启动多种信号通路直接参与调控细胞死亡途径.因此,通过靶向内质网应激信号通路以及相关重要调控分子为肿瘤靶向治疗提供了一种有前景的新策略.　　目前,通过干预性手段诱导持续性内质网应激促进肿瘤细胞的死亡是研究肿瘤治疗的重点.这些治疗策略主要是抑制UPR信号调控通路的重要组分以及与蛋白质降解相关的蛋白酶体.通过抑制内质网中蛋白质稳态的修复过程,增加细胞内质网中错误蛋白质的不断累积,促进过度内质网应激在肿瘤细胞中持续发生而导致细胞死亡.这些内质网应激诱导药物的肿瘤杀伤效应很大程度上依赖于错误蛋白在内质网中的累积过程,因此对某些蛋白质合成和分泌功能较强的分泌型细胞效果更明显.此外,由于内质网应激同时具有促进细胞死亡效应和保护细胞存活的两方面的功能,在某些正常组织细胞中内质网应激同样可能呈现高表达状态.因此,常规的内质网应激诱导剂可能通过启动持续性内质网应激对正常组织细胞引起严重的毒副作用.而目前尚缺乏通过直接影响蛋白质折叠和修饰过程诱导肿瘤细胞特异性内质网应激的试剂用于抗肿瘤治疗.因此,发展针对肿瘤细胞具有特异性的内质网应激诱导剂对提高肿瘤治疗效果、降低药物毒副作用具有重要意义.　　细胞中内质网和线粒体通常具有结构的连续性,内质网与线粒体可以通过形成的复合物在线粒体外膜相互连接并形成转运通道,在促进内质网和线粒体物质传递、调控线粒体代谢稳态和细胞凋亡通路发挥重要作用.同时,线粒体可以通过与内质网相连接的MFN2分子直接调控细胞内质网应激.此外,线粒体作为细胞能量产生,生物合成以及多种信号通路调控的重要细胞器,在肿瘤的发生和发展中均起重要作用,是目前肿瘤靶向和肿瘤治疗研究中的重要靶点.因此,靶向肿瘤细胞线粒体可能作为诱导肿瘤细胞特异性内质网应激的潜在靶点,对发展同时具有肿瘤靶向特性和肿瘤治疗作用的持续性内质网应激诱导试剂具有重要价值.前期研究报道了七甲川花菁类近红外荧光小分子具有亲脂性阳离子特性,对细胞线粒体具有特异性靶向作用,同时该类小分子化合物通过肿瘤细胞高表达的有机阴离子转运蛋白(OATPs)的介导对肿瘤细胞具有特异性靶向作用.在本研究中,我们通过对具有线粒体靶向特性的七甲川花菁结构的进行酯和氨基酸衍生物修饰,合成了一系列具有肿瘤细胞靶向特性的新型小分子化合物.通过筛选并鉴定出能够诱导肿瘤细胞特异性内质网应激的近红外荧光小分子 IR-34,研究将其作为一种具有靶特异性的内质网应激诱导剂在肿瘤靶向诊断和治疗中的前景和意义,并探索其可能的作用靶点和调控机制,为发展更有效的肿瘤诊断治疗策略提供了新的参考.　　研究方法与结果:　　1.我们通过对具有线粒体靶向特性的七甲川花菁结构的进行酯和氨基酸衍生物修饰,合成了一系列具有线粒体靶向作用的新型近红外荧光小分子.通过对肿瘤细胞靶向特性、选择性杀伤作用以及对内质网应激信号通路影响,筛选出能够通过诱导持续性内质网应激靶向杀伤肿瘤细胞的小分子化合物.　　1.1参考之前的合成方法,通过对IR-780的N-烷基侧链进行酯和氨基酸衍生物修饰,成功合成一系列新型七甲川花菁类小分子化合物,并鉴定出新合成的小分子具有良好荧光稳定性,最大吸收峰和最大发射峰均在近红外光谱范围内(700-900nm).　　1.2通过鉴定对肿瘤细胞线粒体靶向特性、促线粒体ROS生成特点以及对内质网应激相关信号分子的影响,从8个小分子化合物中我们筛选出了IR-34能够在短时间内快速促进线粒体ROS大量产生,明显促进内质网应激相关信号分子的激活,作为我们肿瘤细胞靶向杀伤作用研究的潜在小分子.　　1.3在不同类型的肿瘤细胞中明确IR-34对肿瘤细胞的选择性蓄积能力,同时在小鼠皮下荷瘤模型以及临床肿瘤标本中进一步检测 IR-34 对肿瘤细胞的近红外荧光成像作用及特点.　　2.明确IR-34促肿瘤细胞持续性内质网应激的效应及特点,观察IR-34对肿瘤细胞形态变化及促肿瘤细胞死亡特点,研究其作为肿瘤细胞特异性内质网应激诱导剂用于抗肿瘤治疗的潜在意义.取得的主要的结果如下:　　2.1通过对IR-34处理后的肿瘤细胞A549进行RNA-seq检查发现,IR-34处理后的肿瘤细胞24小时后内质网应激标志物HSPA5 (BIP), XBP1, DDIT3 (CHOP), ATF3均表达增加.Real-time qPCR检测进一步明确IR-34能够促进肿瘤细胞内质网应激通路的激活,BIP和CHOP表达增加.　　2.2 Western-blot检测表明IR-34能够在不同类型的肿瘤细胞中(A549、HepG2、MCF-7)均能促进内质网应激相关分子 Calnexin、PDI、BIP、PERK、IRE1α、CHOP表达增加,并且具有浓度和时间相关性.内质网应激抑制剂4-PBA能够明显抑制IR-34对肿瘤细胞内质网应激相关分子的影响.　　2.3 IR-34能够促进肿瘤细胞质中空泡形成,与细胞死亡直接相关.透射电镜下观察到 IR-34处理后线粒体发生肿胀,内质网空泡化并形成网格状,可能与细胞质中的空泡形成有关.此外,明确 IR-34可能通过诱导持续性内质网应激促进细胞凋亡和副凋亡发生引起肿瘤细胞死亡.　　2.4 IR-34促进肿瘤细胞内高水平和高活性ROS的产生.ROS抑制剂能够明显抑制 IR-34促肿瘤细胞内质网应激信号通路的激活,降低 IR-34促肿瘤细胞死亡效应.此外,IR-34促肿瘤细胞ROS产生和内质网应激信号通路的激活与铁离子水平密切相关.　　3.利用小分子化合物自身近红外荧光特性研究IR-34在肿瘤细胞线粒体的具体作用靶点以及如何通过靶向线粒体调控内质网应激的具体分子机制.主要的研究结果包括以下几部分:　　3.1通过与多种细胞器特异性荧光探针共染明确线粒体是IR-34在肿瘤细胞的特异性作用靶点.通过使用不同ROS抑制剂处理发现线粒体特异性ROS抑制剂ALCAR能明显降低IR-34促细胞内ROS的产生.同时,线粒体特异性荧光探针 mitoSOX和通用型ROS荧光探针DCFDA共同标记IR-34处理的细胞可以看到IR-34诱导的ROS主要是在线粒体产生.　　3.2 IR-34处理后的肿瘤细胞线粒体功能受损,包括基础氧耗率降低、最大呼吸能力降低.不同浓度 IR-34处理肿瘤细胞后,检测发现细胞线粒体膜电位降低,肿瘤细胞内ATP产生减少,提示IR-34处理后对肿瘤细胞线粒体功能影响显著.　　3.3为了研究IR-34在线粒体中的具有作用靶点,我们采用IR-34标记肿瘤细胞后,将细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳,在近红外荧光成像仪的指导下切取具有近红外荧光信号的胶条,提取胶条中蛋白做蛋白质谱分析其中可能与 IR-34有直接结合的线粒体蛋白质.研究发现IR-34能够抑制肿瘤细胞NDUFS1蛋白质的表达,但是对其mRNA水平影响不明显.　　3.4为了进一步明确IR-34与线粒体复合物Ⅰ蛋白NDUFS1直接结合作用,我们采用NDUFS1抗体进行免疫荧光染色,发现IR-34与NDUFS1蛋白共定位.IR-34标记后的细胞裂解液采用 NDUFS1 抗体进行免疫共沉淀实验,发现与 NDUFS1 抗体特异性结合的蛋白质具有明显的近红外荧光信号,提示通过NDUFS1抗体沉淀下来的蛋白质与IR-34有特异性结合.NDUFS1人重组蛋白在37℃条件下采用IR-34孵育后,检测发现IR-34能够对NDUFS1重组蛋白进行直接裂解,且并不依赖于活化的caspases调控作用.　　4.研究IR-34在体内外模型中对肿瘤细胞的选择性杀伤作用,以及对小鼠肿瘤复发情况的影响.进一步研究 IR-34 对肿瘤细胞选择性蓄积作用的调控机制.主要的研究结果如下:　　4.1 IR-34对不同类型肿瘤细胞(A549、HepG2、MCF-7)杀伤作用明显而对相应的正常细胞(HBE、L02、MCF-10A)杀伤作用并不明显.对临床非小细胞肺癌和肝癌新鲜组织标本中分离出的原代肿瘤细胞的杀伤作用明显而对相应成纤维细胞杀伤作用有限.　　4.2 IR-34能够特异性靶向肿瘤细胞明显抑制小鼠皮下肿瘤的生长,而对小鼠重要器官及其他组织毒副作用不明显.与常规化疗药物顺铂比较,IR-34 对肿瘤复发情况具有明显的抑制作用.　　4.3肿瘤细胞膜高表达的OATPs转运蛋白是介导IR-34选择性进入肿瘤细胞的关键分子.同时,肿瘤细胞中高表达的HIF-1α是影响小分子染料IR-34进入肿瘤细胞的重要因素.　　研究结论:　　1.我们通过对具有线粒体靶向特性的七甲川花菁结构的进行酯和氨基酸衍生物修饰合成了一系列具有肿瘤靶向作用的小分子;筛选出能够通过诱导持续性内质网应激靶向杀伤肿瘤细胞的小分子化合物 IR-34,可作为肿瘤靶向杀伤作用研究的潜在小分子.　　2.进一步明确IR-34能够特异性诱导不同类型肿瘤细胞内质网应激,通过促进细胞凋亡和副凋亡途径的发生选择性杀伤肿瘤细胞.　　3.鉴定了IR-34能够与线粒体复合物Ⅰ蛋白质NDUFS1直接结合,通过破坏线粒体电子传递链,降低线粒体呼吸功能,促进线粒体ROS大量产生诱导肿瘤细胞持续性内质网应激的重要调控机制.　　4.IR-34对不同肿瘤细胞均具有选择性杀伤作用,能够明显抑制小鼠皮下肿瘤生长和复发情况,而对正常组织细胞毒副作用不明显.同时,IR-34 通过肿瘤细胞高表达的HIF-1α及转运蛋白OATPs选择性蓄积于肿瘤细胞中,对肿瘤细胞具有良好的近红外荧光成像作用.　　总之,本文合成并鉴定的新型小分子化合物 IR-34通过调控肿瘤细胞线粒体功能的方法直接诱导肿瘤细胞特异性内质网应激用于肿瘤细胞靶向杀伤,减少对正常组织毒副作用.同时,IR-34 结构本身具有的肿瘤选择性作用和近红外成像特性为肿瘤诊断治疗研究提供一种新的有效策略和潜在有用的小分子化合物.