肽抗生素(peptide antibiotics)是近年来发现的生物体基因编码的具有抗微生物活性的小肽，是生物体天然免疫的重要组成部分。在已分离的800多种肽抗生素中，绝大多数具有良好的抗菌活性和抗菌广谱性，在临床病原菌对传统抗生素耐药性日益严重的今天，肽抗生素作为一种新型的抗感染制剂，其研究倍受人们关注。 本室曾用简并引物从人皮肤角质形成细胞中克隆到一人β型肽抗生素，称hPAB-β，并根据hPABβp的特性设计并筛选到了一个承载分子PaP3.30(16.7kD)，利用该分子能使hPAB-β融合蛋白在大肠杆菌中的表达量达到菌体总蛋白的40％。然而，由于目标蛋白hPAB-β(4.3kD)在整个融合蛋白分子(23.6kD)中只占约1／6，其实际表达量占菌体总蛋白的比率(表达率)仅约7％，产量依然低下。为实现hPAB-β的高效率制备，本研究首先利用同尾酶法设计并构建了hPAB-β多拷贝串联体重组质粒，并从得到的串联体基因工程菌(工程菌)中筛选出最佳工程菌，对其发酵条件进行了优化，经过对表达产物的纯化，最终得到了具有抗菌活性的目标肽抗生素hPAB-β。主要研究内容和结果如下： 1．hPAB-β多拷贝串联体的设计、构建与表达：根据hPAB-β基因序列设计1对引物，在上游引物5’端引入BamHI、AvaⅢ酶切位点和羟胺裂解位点(Asn Gly)编码序列，在下游引物5’端引入HindⅢ、PstⅠ酶切位点和Asn-Gly编码序列，将PCR扩增的hPAB-β1拷贝片段克隆到pUCm-T载体中，再经BamHI／HindⅢ双酶切后亚克隆到pQE-31质粒中，转化大肠杆菌JM109，即可获得hPAB-β1拷贝工程菌。利用AvaⅢ(ATGCA T)与Pstl(C7GCA G)互为同尾酶的特性，二酶切割后的粘性末端均为TGCA，可以进行连接，但连接后的新序列ATGCAG不被二酶再识别，采用XhoⅠ(DQE31质粒上有该酶酶切位点)／AvaⅢ和XhoⅠ／PstⅠ分别双酶切1拷贝重组质粒，回收大片段pQE-hPAB-β(1)和小片段hPAB-β(1)，进行连接，转化JM109后，即可得到hPAB-β2拷贝串联体工程菌。同理，构建了3～8拷贝串联体工程菌。对构建的重第三军医大学硕士学位论文组质粒进行BamHFHindlH双酶切鉴定和核普酸测序，结果表明，从1一8拷贝重组质粒中可分别切出大小约为154bp、292bp、430bp、568bp、706bp、844bp、982bp和1120bp的片段，与预期结果相符，核营酸测序证实其序列和阅读框完全正确。卜8拷贝重组质粒在JM 1 09中可分别表达分子量约为6，7kD、1 1 .6kD、16.4kD、ZI.3kD、26.2kD、31.okD、 35.9kD和4o.skD的蛋白质，与预期结果相符，采用抗h队B一p合成肤多克隆抗体进行western blotting分析，进一步证实了各拷贝菌均可表达具有正确抗原性的相应大小蛋白质。 2.多拷贝串联体工程菌的筛选:采用Quaniity One软件分析l一8拷贝工程菌中目标蛋白表达率分别为2.6%、19.7%、27.8%、28.0%、24.5%、10.2%、7.9%和5.7%，选择表达率较高的2一5拷贝工程菌，从细菌产量、融合蛋白表达形式、包涵体溶解性、亲和层析效果等方面进行比较分析。结果表明，各菌湿菌产量分别为2.1929几、3.】539几、1.7479几和2.4249几;目标蛋白均以包涵体形式存在，其中2、3拷贝菌包涵体在含smol/L尿素溶液中可完全溶解，通过Ni一Nl’A亲和层析可完全捕获目标融合蛋白，轻胺可将融合蛋白裂解为hPAB一p单体，而4、5拷贝菌包涵体不能完全溶解，降低了目标蛋白的得率;用hPAB一p合成肚兔抗血清对基因工程表达的hPAB一p3拷贝融合蛋白进行westem blotting鉴定，结果为阳性，表明重组表达蛋白的抗原性正确。综合上述实验，确定3拷贝菌为制备重组hPAB一p的最佳工程菌。 3.3拷贝串联体工程菌发酵条件的优化:采用摇瓶对发酵培养基、发酵温度、IPTG诱导时机、IPTG诱导浓度、IPTG诱导时间、发酵培养基中葡萄糖初始浓度、微量元素初始浓度、菌种接种量等条件进行摸索;在此基础上，采用3.7L发酵罐对发酵pH值、溶氧条件(POZ)和补料一分批发酵的补料时机、方式等参数进行优化，最终确定了3拷贝菌的发酵罐发酵条件为:采用含0.1%葡萄糖和10一7mol/L微量元素的改良Mg一cA培养基，接种7%种子菌，在37oC，pH7.4，Po:为300;0一400;0条件下培养4h:(A6。。:Inl七2.2)，以连续加速方式补料至对数后期(Po:由下降转为上升)，加终浓度为100林mol/L的 IPTG诱导表达shr。按此条件，取ZL培养基发酵，以初速度o.7ml/min，加速度0.olml/l1l inZ，加3倍量补料，细菌产量可达39.29几。 4.重组hPAB一p的纯化及活性鉴定:采用Ni一NTA亲和层析对提取的3拷贝融合蛋白进行初步纯化，纯度达到80%以上;采用终浓度为Zmol/L的羚胺对融合蛋白进行裂解(pHg.0，45℃，搅拌反应Zhr)，可解离出与hPAB一p合成肤分子量相符的小肤，进而用SOURCE 3ORPC填料对裂解产物进行反相层析纯化，使目标肤纯度达到90%以上，同时实现了脱盐，TI-icine一SDS一PAGE电泳结果表明反相层析洗脱峰为目标肚峰:第三军医大学硕士学位论文采用GsH/GsSG系统对目标肤进行复性，之后用Bio一gel P6 DG分子筛层析(分离范围1000一6000Da)进一步纯化，使目标肤的纯度提高到95%以上;采用抗h队B一p合成肤多克隆抗体进行Western blotting鉴定，证实了重组