霍乱弧菌（V.cholera）是一种曾经严重威胁人类生存，迄今仍对人类健康 构成威胁的烈性病原体，其最主要的致病因子是霍乱毒素（cholera toxin，CT）。 完整的霍乱毒素由一个A亚单位和5个B亚单位组成。其中A亚单位是毒力活性部 分，具有ADP-核糖基转移酶活性；B亚单位毒副作用很小，但能识别所结合细胞表 面的受体──神经节苷脂(G_M1)，是霍乱弧菌主要的保护性抗原之一。CtxB加灭活 的霍乱弧菌死菌苗的免疫效果远胜于单纯的死菌苗的免疫效果。因此CtxB的高效 表达受到研究者的极大重视。研究发现，无论核酸序列还是氨基酸序列，霍乱弧菌 的CT和大肠杆菌的肠毒素（LT）具有70％－80％的同源性，所以对CtxB基因在大肠 杆菌中的高效表达研究得比较多，但对子其在异源疫苗中的表达，研究相对较少。 痢疾是一种常见和多发性传染病，全球每年有2亿人次患细菌性痢疾，死亡650 万人，痢疾菌是患病的主要原因。痢疾菌分为四群：痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、 鲍氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌。痢疾的流行型别有地区特点。我国以福氏志贺氏菌 为主，近年来在城镇郊区宋内志贺氏菌有升高的趋势。发展疫苗是预防痢疾流行的 重要途径。目前有两个双价苗已经通过鉴定。但这两个双价苗中一个由于含转座子 而导致整个表达系统不稳定；另一个存在抗药性基因，药物抗性在菌株之间的传播 会增加治疗的难度，所以有抗药性的疫苗是不能用于临床的。为了克服这一缺点， 军事医学科学院生物工程研究所基因工程室利用载体/宿主平衡致死系统构建了抗 宋内和福氏2a的双价菌苗侯选株 2457TDI1。其基本的思路为野生型福氏2a 2457T 株中的asd基因缺失，（asd基因是细菌的管家基因，编码天冬氨酸半醛脱氢酶， 是细菌赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸──DAP合成途径中的一种关键 酶）形成的突变体在LB培养基中的生长依赖于DAP的存在。然后将asd基因克隆 至含O-抗原基因的宋内I相大质粒中，转化asd^-的突变体后，恢复了突变体在LB 培养基中的生长能力，这样就构建成了以asd基因作为筛选标志的载体/宿主平衡 致死系统。2457TDI1菌株的优点是在没有任何抗性作选择压力的情况下，表达外 源保护性抗原的质粒在宿主菌中能稳定存在。 就目前的发展来看，单独预防霍乱和痢疾的疫苗已经存在，但令人满意的联合 疫苗还没上市，而构建联合疫苗又是当今的发展趋势。所以本实验的目的就是在上 述己经构建好的二价痢疾疫苗2457TDI1 中引入编码霍乱毒素B亚单位的基因CtxB，使CtxB基因在异源疫苗株中稳定表达，最终形成抗霍乱和痢疾的多价疫苗 侯选株。 为达到这一目的，我们完成了以下工作： 1．以 DHS a （pMT999）为模板，成功克隆了他抗性基因片段。 重组质粒在宿主菌中的稳定存在需要有外界的抗性选择压力，随着抗药性菌株 1 陕西师范大学硕士学位论文 的出现和扩散，传统的抗生素作为筛选标志的方法，已经不受欢迎，所以我们选择 了Hg抗性基因作为CtXB表达载体的筛选标志。Hg抗性基因来源子pMT999中的转 座子Tn501，在此转座子中含有完整的Hg抗性基因操纵子，全长2922hp，包括merR， inerT，me凡，meN。其中me叩编码调节蛋白；inerT，me凡编码转。蛋白；med编 码还原酶。实验以 DHS a（pMT999）为模板，通过全菌 PCR扩增出汞抗性基因片段， 电泳图谱鉴定，证明正确。 2．成功构建了CtXB的表达载体pBRC09。 外源性基因高效表达，理论上要求载体中有强启动子和高拷贝复制子存在。但 本实验中CtXB的过高表达对细胞有一定的毒害作用，而且会占用细胞内过多的资 源而导致细胞死亡，所以实验选用了中等强度的启动子和中度拷贝的复制子。 门)用EcoR和Bsl 11双酶消化质粒pMGL102回收的片段中除却ctxB的完整序 列外，还包括fi－lactamase启动子，即内酚胺酶启动子（中等强度的启动子）。而 且在回收的长约 1．SKb的片段中还含有Xba1Clal之间的序列，根据曹诚等人的 研究表明，该序列也具有一定的启动子活性。通过p－lactamase启动子和具有启 动子活性的序列，就使得CtXB有效但又不过量表达。当然在表达载体中，还须有 终止子的存在，有资料表明，在ctXB中就包含了自身的起始和终止信号。 （2）载体中复制子的拷贝数与外源基因的表达效率有一定有关系。一般来讲，复 制子的拷贝数越高，其外源基因的表达也就越高。PBR322的复制子，为中度拷贝 复制子，其拷贝数大约在20－30之间，被本实验所采用。 PCR扩增、酶切回收后，将Hg抗性基因片段、CtXB片段、p8R322复制子片段 连接，转化受体菌 DHS a，挑取阳性克隆并酶切鉴定，证明正确，命名为 pBRC09。 3．ELISA和 Western blot检测了 CtxB在痢疾杆菌中的表达。