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目的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)与多种胃部疾病密切相关,在多种胃肠外疾病中也起作用,国际肿瘤研究机构已将其列为I类致癌因子。H.pylori在全球感染率近50%,在发展中国家,可高达80%以上。目前针对H.pylori感染的联合疗法(抗生素联合质子泵抑制剂)存在明显不足:医疗费用高、较低的患者依从性、易产生耐药性、不能彻底根除细菌、不能防止再感染。H.pylori疫苗接种有助于H.pylori相关性疾病的发病率。目前所研究的H.pylori治疗性疫苗大多采用H.pylori全菌或全菌裂解物,或H.pylori毒性蛋白如尿素酶、空泡毒素、毒素相关蛋白、中性粒细胞激活蛋白等,单独或联合不同佐剂进行接种,在动物模型中均能引起保护性应答。尿素酶是H.pylori中含量最为丰富的蛋白,既是H.pylori的定植因子又是毒力因子,并且在各菌株中相对保守,其B亚单位(UreB)以其无毒性成为疫苗设计的首选保护性抗原。在宿主体内,蛋白抗原主要是通过表位发挥作用的,蛋白抗原引起的细胞反应主要是由免疫优势表位引起的特异性的细胞反应,因此,明确UreB蛋白抗原的表位,特别是优势表位,利于发展更有效的H.pylori疫苗。本课题旨在用基因工程方法分段表达UreB蛋白,并对其进行免疫学性质分析,获得有免疫学活性的UreB片段;用H.pylori全菌皮下免疫C57BL/6小鼠,借助DC2.4细胞的抗原递呈作用,建立体外筛选UreB优势表位的细胞学实验方法,为精确筛选UreB优势表位奠定方法学基础,此研究将为制备高效的表位疫苗提供理论指导。方法1.用DNASTAR和DeepView/Swiss-PdbViewer 3.7 (SP5)软件分析UreB结构和全基因序列,以覆盖该蛋白全长、不遗漏表位为原则,选择UreB全基因序列的分割点,设计UreB五个截断片段U1 (1～185aa)、U2(98～294aa)、U3(179～380aa)、U4(292～476aa)和U5 (375～569aa)。2.以本室前期获得的重组UreB为模板,采用PCR方法扩增U1、U2、U3、U4和U5五个片段,并构建到原核表达载体pET-11c (+)中,通过NdeⅠ/EcoRⅠ酶切鉴定阳性重组子,构建PET-11c -U1、PET-11c -U2、PET-11c-U3、PET-11c-U4和PET-11c -U5五个重组质粒,将重组质粒测序结果与GenBank数据对比。3.将PET-11c -U1、pET-11c -U2、pET-11c -U3、pET-11c-U4和pET-11c -U5五个重组质粒分别转化到大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达, SDS- PAGE鉴定重组蛋白表达,免疫印迹鉴定其抗原性。4.用初步纯化的重组片段U1、U2、U3、U4和U5以100μg/只/次口服免疫BALB/C小鼠,同时做PBS组对照,抗原加弗氏完全佐剂(1:1)乳化初次免疫后,间隔一周加弗氏不完全佐剂(1:1)再次免疫三次。末次免疫7天后,ELISA检测免疫后抗血清,鉴定重组片段的免疫原性。5.在体外鉴定C57BL/6小鼠细胞的Th1型细胞应答:用H.pylori超声破碎物以100μg/只/次皮下免疫不同性别C57BL/6小鼠,抗原加弗氏完全佐剂(1:1)乳化初次免疫后,间隔一周加弗氏不完全佐剂(1:1)再次免疫三次。于末次免疫7天后取小鼠淋巴结及脾脏,分别分离其淋巴结细胞和脾细胞。用PMA和离子霉素联合刺激分离出的淋巴结细胞和脾淋巴细胞,流式细胞术检测其中分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例。6.为消除胰酶对DC2.4细胞的影响,未用胰酶处理DC2.4细胞,倒置显微镜观察其细胞形态,流式细胞术测定DC2.4细胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD86的表达水平。7.为优化DC2.4细胞的抗原递呈效果,确定DC2.4细胞负载抗原并成熟的最佳条件:用UreB联合LPS及TNF-α刺激DC2.4细胞,于培养的不同时间收集DC2.4细胞悬液,测定DC2.4细胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD86的表达率,获得负载UreB抗原的成熟的DC2.4细胞。8.为获得大量的UreB特异性的T细胞,在体外,负载UreB的成熟的DC2.4细胞与H.pylori免疫小鼠的脾淋巴细胞分别以1:1、1:2、1∶5的比例混合培养, 96孔板每孔含1×105个脾淋巴细胞,终体积为200μL,在37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养5 d后,再添加IL-2(100 U/mL),继续培养2 d后收集细胞悬液。9.为了确定混合细胞应答的的最适比例,将UreB特异性的T细胞与负载UreB的成熟的DC2.4细胞分别以1:1、1:2、1∶5的比例混合培养,流式细胞术测定分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例。结果1.成功克隆了U1 (1～185aa)、U2(98～294aa)、U3(179～380aa)、U4(292～476aa)和U5 (375～570aa) 5个目的片段,成功构建了PET-11c -U1、PET-11c -U2、PET-11c-U3、PET-11c-U4和PET-11c -U5五个重组质粒;经测序所得产物基因序列与Genbank数据相符。2.将PET-11c -U1、PET-11c -U2、PET-11c -U3、PET-11c-U4和PET-11c -U5五个重组质粒分别转化到宿主菌大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG作用4h诱导表达,经SDS- PAGE显示,重组蛋白U1、U2、U3、U4和U5均在大肠杆菌E.coli BL21中成功表达,诱导出的蛋白分子量分别约为20.0kDa、21.0kDa、22.0kDa、21.0kDa和22.0kD;免疫印迹和ELISA显示五个重组片段均具有良好的抗原性和免疫原性。3.用PMA联合离子霉素刺激分离出的淋巴结细胞和脾淋巴细胞,流式细胞术结果显示雄性C57BL/6小鼠脾淋巴细胞组分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例最高。4.流式细胞术测定DC2.4细胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD86的表达水平,显示胰酶消化后DC2.4细胞MHC-II类分子呈低水平表达而协同刺激分子CD86呈高水平表达;而未用胰酶处理的DC2.4细胞MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD86的表达水平均较低。5. UreB负载DC2.4细胞24h,加入LPS及TNFα继续刺激12h, DC2.4细胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子的表达均处于较高水平,获得了负载UreB的成熟的DC2.4细胞。6.通过流式细胞术测定CD4+T细胞IFN-γ的分泌水平,确定了混合细胞反应的最适比例:在体外,负载UreB的成熟的DC2.4细胞与H.pylori免疫小鼠的脾淋巴细胞以1:2的比例混合培养,培养的第7天可获得大量的UreB特异性的T细胞,将载UreB的成熟的DC2.4细胞与该UreB特异性的T细胞负再以1:2的比例共培养,细胞群中分泌IFN-γ的CD4+T细胞的比例最高。结论1. UreB的分段表达,为全面精确鉴定UreB表位奠定了实验基础。2. DC2.4是未成熟的永生化的克隆DC细胞,易于培养,可较好递呈UreB蛋白。3.初步建立了UreB免疫优势T细胞表位筛选的体外细胞学实验方法,为分析UreB优势表位,发现新的UreB保护性表位奠定了实验基础。