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目的:
为了研究肿瘤细胞TLR8的表达水平及其与肿瘤发生发展的关系,考察了13种人肿瘤细胞系TLR8 mRNA转录的差异；选择TLR8 mRNA转录较高的Hela细胞,探讨TLR8激动剂CL075对其生物学特性的影响；以人宫颈癌患者为研究对象,检测宫颈癌患者癌组织TLR7、TLR8、TLR9及Bcl-2、VEGF mRNA的转录情况,分析TLR8,TLR7和Bcl-2,VEGFmRNA水平的相关性,为进一步研究宫颈癌的发生机制和寻找新的治疗靶点奠定基础。
方法:
(1)采用PCR方法,以含有TLR8基因的pcDNA3.1-TLR8质粒为模板,扩增TLR8基因,将扩增得到的TLR8基因克隆至pMD18-T载体,实时定量检测13种人肿瘤细胞系TLR8基因的表达,以筛选TLR8 mRNA转录较高的肿瘤细胞系。
(2)免疫荧光法检测Hela细胞TLR8的表达。
(3)应用TLR8激动剂CL075按0.5μg／ml、1μg／ml、2μg／ml和2.5μg／ml的浓度分别加入Hela细胞培养体系,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡的变化,MTT法检测细胞增殖的变化,同时应用RT-PCR法检测CL075刺激后COX-2、Bcl-2、VEGF mRNA转录水平的变化。
(4)无菌收集江苏大学附属人民医院妇产科15例宫颈癌患者组织标本,10例健康志愿者宫颈组织标本。
(5)采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测人宫颈癌组织TLR7、TLR8、TLR9及Bcl-2、VEGF的mRNA转录水平；应用直线回归法分析宫颈癌患者癌组织TLR8／7与Bcl-2、VEGFmRNA转录的相关性。
结果:
(1)构建pMD18-T-TLR8质粒,将扩增得到的TLR8基因克隆至pMD18-T载体,经序列测定显示,与GenBank中人TLR8基因序列完全一致。研究表明Hela细胞系TLR8 mRNA转录水平较高。
(2)免疫荧光定位检测发现,Hela细胞表达的TLR8定位于胞浆内。
(3)经1μg／ml CL075刺激后Hela细胞的增殖能力明显增强,处在G2／M和S期的细胞比例增加。此外,宫颈癌Hela细胞COX-2、Bcl-2、VEGF mRNA转录水平,在CL075刺激的48h内呈现转录明显增高的趋势。
(4)QRT-PCR分析结果显示:与健康对照组比较,宫颈癌患者癌组织TLR7和TLR8 mRNA的转录高于健康对照组,而TLR9 mRNA的转录同健康对照组并没有显著差异,并且宫颈癌患者癌组织TLR8mRNA与Bcl-2、VEGFmRNA的转录有一定的相关性,而TLR7mRNA与Bcl-2、VEGFmRNA的转录并无相关性。
结论:
(1)人宫颈癌Hela细胞系表达TLR8。
(2)TLR8激动剂CL075作用于人宫颈癌Hela后,可促进Hela细胞的增殖。
(3)宫颈癌患者癌组织TLR7和TLR8 mRNA的转录高于健康对照组,而癌组织TLR9mRNA的转录同健康对照组并无显著差异。此外,TLR8与Bcl-2、VEGFmRNA的转录成正相关；而癌组织TLR7与Bcl-2、VEGFmRNA的转录无相关性。