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目的:雄黄是我国传统的矿物类中药,其主要成分是二硫化二砷（Arsenic disulfide,As2S2）,在中医学中常作为“以毒攻毒”药物与其他中药配伍使用。肝脏是雄黄毒性作用的主要靶点。炎症反应被认为是雄黄诱导肝损伤的机制之一。Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体活化促进炎症因子的切割和成熟,在炎症反应中具有重要作用。前期研究表明NLRP3炎症小体途径参与雄黄诱导的小鼠肝脏损伤。自噬是一种胞质过程,在应激条件下,将变形、受损、衰老的蛋白质和细胞器运输到溶酶体进行降解,以维持细胞内稳态。研究表明自噬对药源性肝损伤具有保护作用。NLRP3炎症小体的活化与自噬之间存在密切关系。目前,自噬对雄黄诱导肝脏炎性损伤和NLRP3炎症小体途径的影响还未见报道。本研究建立雄黄暴露小鼠肝损伤模型,通过自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）干预雄黄诱导肝损伤小鼠肝脏自噬水平,探究自噬对雄黄暴露小鼠肝脏炎性损伤和NLRP3炎症小体途径的影响,为雄黄肝脏毒性的机制研究和治疗靶点的阐明提供实验依据。研究方法:健康成年雄性昆明小鼠（体重20-25 g）,按照体重随机分为六组:（1）对照组:灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠（Carboxymethyl Cellulose-Na,CMC-Na）溶液,腹腔注射0.5%二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）;（2）雄黄组:灌胃给予雄黄混悬液（1.35 g/kg,以0.5%CMC-Na为混悬介质）,腹腔注射0.5%DMSO;（3）RAPA对照组:灌胃给予0.5%CMC-Na溶液,腹腔注射RAPA（2 mg/kg,0.5%DMSO为溶剂）;（4）RAPA干预组:灌胃给予雄黄混悬液（1.35g/kg,以0.5%CMC-Na为混悬介质）,腹腔注射RAPA（2 mg/kg,0.5%DMSO为溶剂）;（5）3-MA对照组:灌胃给予0.5%CMC-Na溶液,腹腔注射3-MA（15mg/kg,0.5%DMSO为溶剂）;（6）3-MA干预组:灌胃给予雄黄混悬液（1.35 g/kg,以0.5%CMC-Na为混悬介质）,腹腔注射3-MA（15 mg/kg,0.5%DMSO为溶剂）。灌胃每日一次,连续灌胃八周;第六周开始腹腔注射,每两天一次,共注射三周。最后一次染毒24 h后,每组选取3只小鼠,经左心室灌流固定后进行H＆E染色,在显微镜下观察肝脏形态改变;各组其余小鼠于最后一次染毒24 h后摘眼球取血,分离血浆,快速摘取肝脏,冻存,进行以下实验:1、分光光度法测定血浆及肝组织谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）活力;2、ELISA法测定血浆白介素1β（Interleuki-1β,IL-1β）浓度;3、透射电镜观察小鼠肝脏细胞自噬,单丹磺酰尸胺（Monodansyl cadavrine,MDC）法测定自噬囊泡的形成;4、实时荧光定量（Real Time-Quantitative PCR,RT-q PCR）和蛋白印迹法（Western Blot,WB）法检测自噬和NLRP3炎症小体途径相关分子的m RNA和蛋白表达。结果:1、雄黄暴露激活小鼠肝脏自噬,3-MA和RAPA调控雄黄暴露小鼠肝脏自噬。与对照组相比,雄黄暴露组小鼠肝脏自噬小体数量增加,MDC荧光强度显著升高,自噬相关蛋白p62、III型磷脂酰肌醇激酶（Vacuolar Protein Sorting 34,VPS34）、微管相关蛋白轻链3II（microtubule-associated proteins light chain 3,LC3II/I）表达升高,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白受体（mammalian target of rapamycin,m TOR）表达下降;自噬相关基因5（Autophagy related gene 5,Atg5）、自噬相关基因7（Autophagy related gene 7,Atg7）m RNA表达升高。RAPA进一步上调雄黄暴露小鼠肝脏MDC荧光强度,增加LC3II/I蛋白和Atg7 m RNA表达,降低m TOR和p62的蛋白表达。3-MA降低雄黄暴露小鼠肝脏VPS34、LC3II/I蛋白和Atg5 m RNA表达,增加p62蛋白表达。2、RAPA减轻雄黄暴露小鼠肝脏炎性损伤,3-MA加剧雄黄暴露小鼠肝脏炎性损伤。与对照组相比,雄黄暴露组小鼠血浆中AST、ALT、LDH活力升高,肝组织AST活力下降,ALT未见明显变化;与雄黄组相比,3-MA干预组小鼠血浆及肝组织中ALT和AST活力未呈现明显改变,RAPA干预组小鼠血浆中AST、ALT、LDH水平显著下降,肝组织AST水平显著上升,ALT无明显变化。H＆E染色结果显示对照组、3-MA对照组、RAPA对照组小鼠肝组织结构正常,雄黄暴露组和3-MA干预组小鼠肝组织可见炎性细胞浸润,3-MA干预组肝细胞炎症浸润及核浓缩较雄黄组增加,肝细胞内可见白色脂肪空泡,RAPA干预组炎症浸润较雄黄组减轻,可见少量脂肪空泡。与对照组比较,雄黄组小鼠肝组织肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,Tnf-α）、Il-1β和白细胞介素-6（Interleukin 6,Il-6）m RNA表达升高,血浆中IL-1β浓度呈现升高的趋势;3-MA干预组小鼠肝组织Tnf-α、Il-1β和Il-6的表达和血浆中IL-1β浓度较雄黄组比较有升高的趋势,但无统计学差异;RAPA干预显著组小鼠肝组织Tnf-α、Il-1βm RNA和血浆IL-1β浓度显著降低。3、雄黄暴露小鼠肝脏NLRP3炎症小体途径相关分子蛋白和m RNA表达增加,RAPA下调雄黄暴露小鼠肝脏NLRP3炎症小体途径,3-MA进一步上调雄黄暴露小鼠肝脏NLRP3炎症小体途径。RT-q PCR及Western blot结果显示,与对照组比较,雄黄组小鼠肝组织Nlrp3、含半胱天冬蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated Speck-like protein containing a CARD,Asc）m RNA表达增加,NLRP3、消皮素D蛋白（Gasdermin D,GSDMD）、Gasdermin D蛋白N端结构域（Cleaved gasdermin-N domain,N-GSDMD）、ASC、半胱天冬蛋白酶1（Cysteinylaspartate specific proteinase-1,Caspase-1）、IL-1β蛋白表达增加;与雄黄组相比,3-MA干预组NLRP3炎症小体相关基因Nlrp3、Asc和相关蛋白NLRP3、GSDMD、N-GSDMD、ASC、Caspase-1、IL-1β表达显著上升;RAPA干预组NLRP3炎症小体相关基因和蛋白表达显著下降。4、RAPA下调雄黄暴露小鼠肝脏NLRP3炎症小体途径可能与抑制核因子κB（Nuclear factor-kappa-B,NF-κBp65）入核活化有关。与对照组相比,雄黄暴露组小鼠肝组织NF-κBp65总蛋白及核内蛋白表达显著升高,而RAPA干预组小鼠肝组织NF-κBp65总蛋白及核内蛋白表达较雄黄组显著下降。结论:1、雄黄暴露小鼠肝脏自噬增强,3-MA和RAPA调控雄黄暴露小鼠肝脏自噬。2、3-MA进一步上调NLRP3炎症小体途径,加重雄黄诱导的肝脏炎性损伤。3、RAPA下调NLRP3炎症小体途径,减轻雄黄诱导小鼠肝脏炎性损伤,其原因可能与抑制NF-κBp65入核活化有关。