深海宏基因组文库活性物质筛选及深海真菌活性物质的筛选和研究

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海洋是地球最重要的生态系统之一。由于海洋尤其是深海生态环境的特殊性,深海微生物具有一些特异的代谢途径和遗传背景,深海微生物次生代谢产物具有化学结构奇特、新颖,生物活性多样等特点。对深海微生物尤其是极端环境微生物的研究开发将会在工业、医药、环境保护等方面具有潜在的、巨大的应用价值。   微生物蕴藏着巨大的菌种与基因资源,但仅有0.1%~1%的微生物在现有技术条件下能够培养。宏基因组技术避开了微生物培养和分离,极大地扩展了微生物资源的利用空间,是开发利用未培养和非培养微生物的有效途径。   本文以“亚特兰蒂斯”号科考船于2009年11月在墨西哥California海湾瓜伊马斯深海热液口所采集的样品和中国大洋一号第20航次采集的深海沉积物样品为材料,构建3个高质量的环境文库和6个富集样品文库。从其中4个富集样品宏基因组文库12500个克隆子中得到17株产生颜色的克隆子。对这17株产颜色的克隆子的乙酸乙酯萃取粗提物浸膏,分别进行了细胞毒活性和抗真菌活性的筛选。实验表明,这17株克隆子都具有不同程度的抗真菌活性,而其中11株具有不同程度的细胞毒活性。   对其中5株产生红色物质的克隆子做了转宿主、插入突变研究,发现宿主红色物质的产生是由于外源基因的表达。突变子测序结果表明,这5株克隆子都含有与芳香族降解有关的基因簇。其中,2个克隆子(7F12和17F9)可产生水溶性棕黑色色素,突变子测序结果表明两株克隆子中,水溶性棕黑色色素的产生与4HPPD酶(4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)有关。   测序分析发现,17F9包含4HPPD基因和调控因子TyrR;7F12全长测序结果表明,基因11为也包含4HPPD酶,编码348氨基酸,与Alteromonadales bacterium TW-7(348氨基酸)97%同源。   另一方面,本文利用中国大洋一号第20航次采集的深海沉积物样品进行了真菌富集分离和鉴定。从27份深海沉积物样品中分离出110株真菌,分属于15个属。利用CCK8法对其中的100株深海真菌进行了抗肿瘤活性检测,发现深海真菌具有良好的生物活性,细胞毒阳性率占49%。其中GYP培养基条件下有36株表现出抗肿瘤活性,PDA培养基条件下有34株表现出抗肿瘤活性。同时,不同培养基条件真菌粗提物活性也表现出明显差别。该研究为后期分离鉴定深海真菌产生的生物活性化合物奠定了良好基础。
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