背景与目的： 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是人类致残率最高的疾患之一。由于脊髓损伤后自身神经元的再生能力有限、一旦损伤难以修复，因而损伤后脊髓的结构重建和功能恢复是SCI治疗的关键所在，也是当今生命科学领域研究的热点和难点。 近年来，神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的发现及成功分离培养，给SCI的治疗带来了新的希望，成为最具研究前景的脊髓损伤的治疗方法。NSC具有增殖和分化特性，并能支持、诱导神经的再生，但研究发现NSC移植到SCI局部后大部分分化为各种胶质细胞，而向神经元分化的比率较少，对SCI的修复作用有限。因此探讨NSCs准确定向分化为神经元的机制和技术成为脊髓损伤研究的热点。 研究表明，神经干细胞的增殖分化受到了自身基因及外来信号的共同作用。Wnt/β—catenin信号通路在神经系统的发育中起到了重要作用，其与自身基因及外来信号等诸多因素的共同作用，促进了神经系统的发育。但在脊髓损伤后，Wnt是否有表达及表达的变化尚未见文献报道。已有研究证实，维甲酸能够促进神经干细胞向神经元定向分化，并与Wnt/β—catenin信号通路存在一定的联系，但其具体的作用剂量和机制尚有待进一步的研究。 本课题探讨了脊髓损伤后不同时期Wnt信号重要分子的表达情况，并通过体外培养神经干细胞，观察不同浓度全反式维甲酸干预下，神经干细胞的分化情况以及Wnt信号分子在此过程中的表达变化，同时观察Wnt信号激活剂LiCl对神经干细胞增殖的影响，探讨其相关的作用机制，为神经干细胞的定向分化研究提供新的思路。 方法: 1.采用30只雌性SD大鼠随机分为对照组（假手术组）、实验组脊髓损伤1天、3天、5天、7天、14天组，每组5只。实验组应用NYU打击器致伤脊髓（10g×5cm），术后第1、3、5、7、14天分别取损伤区上下共1cm范围内脊髓组织，提取总RNA，采用半定量RT—PCR的方法检测脊髓损伤组织中Wnt信号的mRNA表达变化。 2.采用1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL和1×107/mL接种密度体外培养大鼠脊髓神经干细胞，观察细胞生长情况，MTT法检测各密度培养的神经干细胞在不同时间点对细胞的增殖效应，选择体外最佳的神经干细胞培养的密度。同时使用免疫荧光染色法对神经干细胞进行鉴定。 3.以1×106/mL的接种密度培养神经干细胞，选用0.1μmol几、1.0μmol/L和10μmol/L浓度的全反式维甲酸体外作用于大鼠脊髓神经干细胞，通过免疫荧光和流式细胞分选技术检测各组细胞分化为神经元的能力，探索促使神经元分化的最佳全反式维甲酸的浓度。 4.以1×106/mL的接种密度培养神经干细胞，选用1.0μmol/L的全反式维甲酸体外作用于大鼠脊髓神经干细胞，使用Western—blot法检测干预前后细胞的Wnt—1、GSK—3β、β—catenin的蛋白表达变化，初步探索在神经干细胞向神经元分化的过程中，Wnt信号相关因子的表达情况。 5.采用前述方法培养神经干细胞，使用GSK—3β特异性的抑制剂LiCl体外作用于大鼠脊髓神经干细胞，MTT法检测各浓度LiCl作用的神经干细胞在不同时间点对神经干细胞的增殖效应，流式细胞仪检测LiCl对神经干细胞细胞周期的影响，Western—blot法检测干预前后细胞的Wnt信号通路相关因子Wnt—l、GSK—3β和β—catenin蛋白的变化，探讨Wnt信号激活对神经干细胞增殖的作用。 结果: 1.脊髓损伤后1d和3d Wnt—1和β—catenin出现高表达，5d后其表达逐渐减弱，14天左右其表达基本恢复到正常水平，而在脊髓损伤后1d和3d GSK—3β呈低表达，5d后其表达逐渐增强。而对照组中Wnt—1和β—catenin及GSK—3β均呈低表达。 2.成功培养出SD大鼠脊髓来源的神经干细胞并鉴定，在体外多次传代后仍具有很强的增殖能力，当神经干细胞接种密度为1×106/mL时，细胞增殖的速度最快，是最佳的接种密度。 3.神经干细胞在完全培养基中主要分化为GFAP阳性的星型胶质细胞，而含有全反式维甲酸的完全培养基可促进神经干细胞向MAP2表达阳性的神经元分化，其中当全反式维甲酸浓度为1.0μmol/L时，促使神经干细胞向神经元分化的比例最高。 4.Western—blot法检测发现，在以1.0μmol/L的全反式维甲酸作用于神经干细胞后，Wnt—1和β—catenin蛋白的表达在分化开始即0天时表达量少，随着维甲酸的干预，在分化第三天时其表达显著增加，在分化第五天时，其表达较第三天有所增强，7天时表达较5天时有所减弱。而在对照组中Wnt—1的表达在分化开始时低表达，分化3d时表达增强，在5d、7d后表达又逐渐减弱。GSK—3β在分化开始时呈低表达，分化3d时GSK—3β的表达有所增强，5d、7d时GSK—3β的表达逐渐减弱。而在对照组中我们发现GSK—3β在分化开始时呈低表达，随着时间的延长，GSK—3β的表达逐渐增高。 5.MTT检测发现LiC1作用后神经干细胞的增殖明显高于对照组，且随着浓度的增加和时间的延长作用越显著，第五天开始细胞的增殖速度开始减缓。流式细胞仪检测细胞周期显示LiC1作用组神经干细胞处于G1期的比例明显低于对照组，而处于S期的细胞比例明显增高且作用与剂量有关。Western—blot结果显示，随着LiC1作用时间的增加，Wnt—1和β—catenin的表达逐渐增强，而GSK—3β的表达逐渐减弱。 结论: 1.Wnt信号在脊髓损伤的早期激活，可能参与了脊髓损伤后修复再生的过程。 2.在适当的分离培养条件下，原代培养出来的大鼠脊髓神经干细胞具有分裂增殖能力，可在体外大量增殖和长期培养，且具有未分化的神经干细胞特异性标记物Nestin表达阳性，证实是神经干细胞。具有自我更新能力，是进行定向诱导分化和神经干细胞移植修复脊髓损伤的良好细胞模型。 3.当细胞接种密度为1×106/mL时神经干细胞的增殖最为活跃，是理想的接种密度，为大量扩增神经于细胞进行下一步的定向诱导分化奠定了基础。 4.全反式维甲酸能诱导神经干细胞向神经元和星型胶质细胞分化。当ATRA浓度为1.0μmol/L时，神经干细胞向神经元分化的比率最高，且作用随时间的延长而显著，以作用7d时分化比例最高，差异有统计学意义（P<0.05） 5.在神经干细胞向神经元分化过程中，Wnt信号是一个由活化到抑制的过程，Wnt信号可能在神经干细胞分化的早期起关键作用。全反式维甲酸可能通过激活Wnt信号来起到诱导神经干细胞向神经元定向分化的作用。 6.通过体外应用GSK—3β特异性抑制剂LiC1可促进神经干细胞增殖，说明LiC1可能通过抑制GSK—3β的表达从而激活Wnt信号通路起到了促进NSCs增殖的作用。Western—blot检测显示随着LiC1作用时间的增加，Wnt—1和β—catenin的表达逐渐增强，GSK—3β的表达逐渐减弱，说明LiC1可有效抑制GSK—3β的表达，从而激活Wnt信号通路。