论文部分内容阅读
Tet家族蛋白可以将5-甲基胞嘧啶(5mC)迭代氧化成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶(5caC)，并且5fC和5caC可以被糖苷酶TDG(thymine DNA glycosylase)介导的碱基切除修复机制(base excision repair，BER)修复为胞嘧啶C，从而形成一条完整的DNA主动去甲基化路径。在受精卵中母源因子Tet3负责亲本原核基因组部分5mC的迭代氧化，并且发现少数位点比如Oct4和Nanog会发生完整的DNA主动去甲基化过程。但TDG不是母源因子而且并不参与父本原核基因组的主动去甲基化，因此目前不能确定受精卵中Tet3迭代氧化5mC产生的5fC和5caC是否由BER途径修复为胞嘧啶。由于Apex1和Xrcc1是BER途径中的关键因子，本论文中我们通过建立Apex1和Xrcc1母源DKO小鼠模型来解答以上困惑。现在我们已经得到Apex1CKO和Xrcc1CKO小鼠。 Tet3蛋白主要由N-末端的CXXC结构域和C-末端的催化结构域构成，其中后者负责Tet3的双加氧酶功能。通过分析人源hTet2和阿米巴虫NgTet1蛋白空间结构发现，哺乳动物Tet家族蛋白C-末端催化结构域中存在一个特殊的low complexity region，我们称之为Loop domain。这个domain在Tet家族三个同源蛋白中相似性最低，并且基本不影响Tet家族蛋白的酶活功能。此外人源hTet2中Loop domain柔韧性很大，只有将其切除掉hTet2蛋白才能正常结晶，而且它在低等生物比如阿米巴虫NgTet1中并不存在。我们猜想Loop domain对于Tet3在早期胚胎重编程过程中发挥生物学意义有着重要调控作用，因此我们试图建立Tet3Loop CKO小鼠模型来探索这一问题。Tet家族蛋白双价氧酶活依赖Fe2+离子，当Tet上结合Fe2+离子的HxD位点突变后，它们就会丧失酶活性。因此我们建立Tet3HD CKI即Tet3酶活性丧失的条件性点敲入小鼠模型，用来进一步深入研究Tet3在早期胚胎甲基化重编程中的作用及其机制。目前我们已经通过孤雄单倍体胚胎干细胞(Androgenetic haploid stem cell，AG-haESC)基因打靶技术得到这两种基因编辑小鼠，下一步将进行详细的表型分析及其分子机制的探索。 虽然体外生化与细胞水平上的实验数据表明5fC和5caC对于基因转录有重要影响，但它们在小鼠层次上的生物学意义并不清楚。我们与其他实验室合作在Tet家族基因上通过大规模点突变筛选手段发现，当Tet3蛋白第940号氨基酸苏氨酸T突变为谷氨酸E或者缬氨酸V后，Tet3基本丧失将5hmC继续迭代氧化为5fC和5caC的酶活性。我们可以利用这两种基因编辑小鼠(即Tet3TE CKI和TV CKI)来探索5fC和5caC在动物水平上的生物学意义。目前我们已经通过AG-haESC基因打靶技术得到这两种基因编辑小鼠，下一步工作将会分析它们的表型，从而揭示5fC和5caC的生物学意义。