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程序性细胞坏死（Necroptosis）是一种由死亡受体介导的、Caspase蛋白水解酶非依赖性的细胞死亡方式,主要由受体相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1）、受体相互作用蛋白激酶3（receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3）和混合系列蛋白激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain like protein,MLKL）调控,与多种疾病密切相关,如神经退行性疾病、缺血性疾病、病毒感染性疾病等。因此,程序性细胞坏死抑制剂的发现对相关疾病的临床治疗具有十分重要的意义。本论文主要开展了程序性细胞坏死抑制剂的发现、靶点研究及结构优化,主要内容包括:一、程序性细胞坏死抑制剂的筛选、生物素探针合成及靶点研究利用课题组氟化合物库（约500个化合物）,在程序性细胞坏死模型上活性筛选发现TAK-632呈现较好保护坏死作用。TAK-632在20μM时几乎完全保护受TNFα,Smac类似物和z-VAD-FMK（TSZ）刺激的HT-29细胞发生坏死,且没有明显毒性,EC50为1.44±0.62μM。作用机制研究发现,TAK-632可特异性与RIPK1和RIPK3结合。为进一步验证其作用靶标,本课题中设计合成了4个TAK-632的生物素探针,活性结果显示,探针TAK-632-Biotin-4在高浓度下可保护HT-29细胞发生的坏死,通过pull down实验证实了化合物TAK-632的作用靶点为RIPK1和RIPK3。TNF-α诱导的小鼠全身免疫综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）模型中,当TAK-632灌胃给药剂量为100mg/kg时,小鼠存活率为70%,小鼠的体温在12 h后有明显回升。这部分内容确定了TAK-632为抗程序性细胞坏死先导化合物,为后续结构优化提供了重要思路。二、双靶点抗程序性细胞坏死TAK-632衍生物的发现及生物活性研究TAK-632体外抗程序性细胞坏死活性较好,但存在其体内给药剂量较高,构效关系不明确等问题。通过基于经验的药物设计,获得了26个目标化合物,初步总结了构效关系。其中,非氰基TAK-632的衍生物B31j,体外抗程序性坏死体外活性是TAK-632的8倍(EC50=0.17±0.03μM),对RIPK1的蛋白结合活性（Kd=97 nM）和RIPK3的蛋白结合活（Kd=77 nM）都明显优于TAK-632。B31j体内活性研究表明,相比TAK-632,B31j在相同口服剂量下可显著的提高小鼠存活率,给药剂量为50 mg/kg时,小鼠存活率提升到90%,当给药剂量为25 mg/kg时,小鼠存活率提升到70%,两个剂量下小鼠体温回升明显加快。因此,非氰基TAK-632衍生物B31j可作为双靶点程序性细胞坏死抑制剂,为后续的结构优化提供了重要先导化合物。三、选择性RIPK3抗程序性细胞坏死TAK-632衍生物的发现及生物活性研究以双靶点TAK-632衍生物B31j为先导,通过两轮结构优化,得到了14个目标化合物,大多化合物表现出纳摩尔的保护活性,其中一类含脲基化合物对RIPK3有很高的选择性。其中,化合物C1m对RIPK3的蛋白结合活性是RIPK1的61.7倍,抗程序性细胞坏死活性EC50为0.44±0.1μM,还可保护鼠源细胞（L929）发生程序性细胞坏死。作用机制研究发现,化合物C1m可抑制RIPK3和MLKL的磷酸化,并直接阻断RIPK1和RIPK3复合体的形成。在TNF-α诱导的小鼠全身免疫综合征模型中,化合物C1m口服剂量为5 mg/kg时,小鼠存活率为90%;在25 mg/kg和50 mg/kg时,存活率提高到100%,小鼠存活率相比TAK-632和B31j都有显著提升。本研究发现了一类体内外活性高、选择性强的RIPK3小分子抑制剂,为抗程序性细胞坏死新药研发提供了重要先导化合物。