L-瓜氨酸(L-citrulline)是一种α氨基酸,具有抗疲劳、抗衰老、提高免疫力和提升男性性功能等活性,在医药、保健品行业应用广泛。L-瓜氨酸可以由精氨酸脱亚胺酶(Arginine Deiminase,简称ADI)转化L-精氨酸得到。红曲霉(Monascus)是一种重要的工业微生物发酵菌,在食品、药品和保健品领域有巨大的应用潜力,其发酵产物具有调节血脂、血压的功能,对糖尿病、帕金森病等多种疾病有较好的预防和治疗效果。本课题采用根瘤农杆菌介导的转化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT),将外源ADI基因随机插入红曲霉基因组中,构建了一种胞内组成型表达ADI的红曲霉工程菌。此工程菌可以用于L-瓜氨酸的生产及红曲相关保健品的开发。本课题采用无缝克隆技术将支原体来源的ADI基因与线性化微型Ti载体p CAMBIA-Pgpd A-Tcbh1-hph-Ptrp C进行连接,连接产物转化至克隆宿主大肠埃希氏菌E.coli DH5α;提取转化子质粒,经基因测序筛选出阳性转化子。至此,用于胞内组成型表达ADI的微型Ti载体p CAMBIA-Pgpd A-ADI-Tcbh1-hph-Ptrp C已构建完成。采用多种条件制备根瘤农杆菌感受态细胞,将微型Ti质粒转化根瘤农杆菌,结果表明采用50 mmol/L Ca Cl2制备的根瘤农杆菌感受态细胞转化子数量最高。采用该条件将微型Ti质粒转化至根瘤农杆菌中,PCR鉴定阳性转化子。将红曲霉孢子悬浮液与根瘤农杆菌转化子于24℃共培养,培养48 h后转移至筛选培养基中。将筛选培养基中的红曲霉抗性菌落用PDA液体培养基培养,培养液用薄层色谱法和二乙酰一肟法检测L-瓜氨酸生产情况。提取能产生L-瓜氨酸的红曲霉转化子基因组进行PCR鉴定,并研究其遗传稳定性。最终得到两个转化子:6号菌与7号菌,性状与野生型红曲霉相近,PCR鉴定ADI基因已成功插入至红曲霉基因组中,证明胞内组成型表达ADI的红曲霉工程菌构建成功。