论文部分内容阅读
目的：本研究通过调节肝脏血红素氧合酶-1(HO-1)的表达,来观察其对肝脏胆盐转运蛋白表达的影响,探讨其对大鼠胆道上皮细胞缺血再灌注损伤(IRI)的作用及其可能机制。方法：1.采用Fei X等报道的方法操作,建立70%肝脏缺血再灌注损伤模型。2.使用化学合成的Ad-HO-1、Ad-HO-1-siRNA,以及空腺病毒载体和生理盐水,经阴茎背静脉注射导入大鼠肝脏,24小时后开腹,建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型。动物随机分为4组：生理盐水对照组(n=32)；空载体组(n=32)；HO-1组(n=32),注射剂量为2×109TU/只,MOI=1；siRNA组(n=32),注射剂量为2×109TU/只,MOI=1。各组再分别于再灌注损伤后1h、1d、1w和2w处死8只大鼠。检测肝脏缺血再灌注后血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TB)、碱性磷酸酶(ALP)水平；ELISA法检测IL-6IL-10、HGF、TNF-a在血清中的水平；荧光定量PCR检测胆盐输出泵(Bsep) mRNA、多药耐药蛋白2(Mrp2) mRNA和牛磺胆酸钠共转运蛋白(Ntcp) mRNA的表达,以及肝组织1d时相点HO-1的mRNA表达；Western Blotting检测肝组织Ntcp蛋白的表达；肝脏及肝门部胆管组织标本行免疫荧光双染及氯醋酸酯酶染色,观察大小胆管及周围肝组织形态结构的变化。结果：1.共成功实行大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型128例,肝脏部分缺血时间为45min。2.相同时相点比较,HO-1组血清ALT、AST、TB、ALP低于对照组和空载体组(p<0.05)：siRNA组血清ALT、AST、TB、ALP含量高于对照组和空载体组(p<0.05)；HO-1组明显低于siRNA组(p<0.01),有统计学意义。3.相同时相点比较, siRNA组血清HGF、IL-10明显低于对照组和空载体组(p<0.05)；HO-1组血清HGF、IL-10明显高于对照组和空载体组(p<0.05)；HO-1组明显高于siRNA组(p<0.01),有统计学意义。HO-1组血清AIL-6、TNF-a低于对照组和空载体组(p<0.05)；siRNA组血清IL-6、TNF-a含量高于对照组和空载体组(p<0.05)；HO-1组明显低于siRNA组(p<0.01),有统计学意义。4.相同时相点比较,HO-1组HO-1、Ntcp、Bsep、Mrp2mRNA表达水平高于对照组和空载体组(p<0.05)；siRNA组HO-1、Ntcp、Bsep、Mrp2mRNA表达水平低于对照组和空载体组(p<0.05)；HO-1组表达水平明显高于siRNA组(p<0.01),有统计学意义。5.相同时相点比较,siRNA组Ntcp蛋白表达水平低于对照组和空载体组(p<0.05);HO-1组Ntcp蛋白表达水平高于对照组和空载体组(p<0.05)；HO-1组表达水平明显高于siRNA组(p<0.01),有统计学意义。6.相同时相点比较,siRNA组免疫荧光双染及氯醋酸酯酶染色上可见：大小胆管上皮细胞模糊,部分胆管基底膜脱落,周围肝细胞松散,伴核变性,严重损伤表现；HO-1组损伤表现较轻,大小胆管上皮细胞清晰,基底膜的连续性可,胆管周围肝细胞排列紧密,未见核变性。结论：1.大鼠肝脏热缺血再灌注损伤模型是一种稳定、可靠、简便的模型,可操作性强。2. Ad-HO-1能有效增加HO-1基因在大鼠肝脏的表达,而Ad-HO-1-siRNA能有效减少HO-1基因在大鼠肝脏的表达。3.缺血再灌注会造成肝功能受损,Ad-HO-1可有效改善肝功能,减少促炎性细胞因子IL-6、TNF-a的表达,增加了保护性细胞因子HGF、IL-10的表达,减轻了大、小胆管的缺血再灌注损伤。4.HO-1保护大鼠胆道缺血再灌注损伤的机制,可能与诱导胆盐转运蛋白高表达有关；胆盐转运蛋白高表达可以促进胆汁的转运和排泄,从而减少具有较强细胞毒性的“毒性胆汁”形成,最终减少胆盐对胆管的损伤。