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羊毛硫细菌素是一类由核糖体合成,含翻译后修饰形成的特殊氨基酸(如羊毛硫氨酸)的抗菌多肽。独特的环状结构使羊毛硫细菌素具有优良的热稳定性,抗蛋白酶降解以及高效的杀菌活性。Bovicin HJ50是牛链球菌(Streptococcus bovis)HJ50产生的一种新的AII类羊毛硫细菌素,其分子包含两个硫醚环(A, B环)和一个特征性二硫键形成的环(C环)。这种特殊的分子结构与其功能之间的关系还不得而知,而其前导肽在指导合成这种结构中所起的作用也非常值得关注。为了阐明bovicin HJ50的结构特征及其与功能的关系,本研究首先利用“体内修饰,体外加工”的半体外生物合成系统(SIVB),制备了毫克级别的bovicin HJ50。将其溶于氘代醋酸缓冲液中,利用二维1H-1H COSY, TOCSY和NOESY,以及1H-13C HSQC,HSQC-TOCSY和HSQC-NOESY分别进行化学位移分配和结构计算。分析结果显示,bovicin HJ50水溶液分子较柔性,不具有整体的三维结构,与AI类的nisin结构差异较大。其中A环结构较收敛,而B,C环结构较松散,不具有规则的二级结构。圆二色谱表征二级结构时发现,bovicin HJ50在水溶液中处于无规则卷曲状态,而在膜模拟环境下形成了较规则的类α螺旋结构。利用上述结构信息,采用定点突变和蛋白酶处理,构建得到了54个bovicin HJ50的突变体及类似物,以获得更加详细的结构特征和功能位点或区域。抗菌活性分析显示,(1)N端电荷对活性影响较小,保守的Gly4与芳香族Trp5都对活性影响较大;(2)A环是一个功能区域,且Lys11,Asp12是关键位点,通过电荷作用影响活性;(3)B环残基对活性影响较小,而Lys30正电荷较重要;(4)C环的亲水性和环状结构与活性密切相关。另外,为了探究bovicin HJ50前导肽对其特异性修饰和加工的影响,本论文将关注点集中在其前导肽二级结构上。通过构建前导肽的突变体,检测对应成熟肽的修饰和产率变化情况,说明bovicin HJ50前导肽的二级结构区在其生物合成过程中起重要作用。我们成功构建了7个bovicin HJ50前导肽二级结构区的突变体(F-16A, V-15E, E-14L,E-8P, E-8K,L-7D, L-4K),MALDI-TOF MS鉴定显示所有突变体对应成熟肽都脱去2分子水,即脱水个数不受影响。结合BovT150切割效率分析发现,F-16A, V-15E, L-4K几乎不影响修饰和加工,E-14L和E-8P的修饰则发生了变化,E-8K可能导致BovT150切割效率下降,而L-7D致使前导肽的切除加工受到强烈抑制。本研究解析了第一个AII类羊毛硫细菌素的水溶液结构,并对bovicin HJ50结构和功能关系进行了较系统的研究,为探究其作用机制打下了坚实基础,这些都对同类羊毛硫细菌素具有较强的借鉴意义。