盆底功能障碍性疾病(pelvic floor disorder, PFD),主要包括盆底器官脱垂(pelvic organ prolapse, POP)和压力性尿失禁(stress urinary incontinence, SUI),是全世界范围内中老年女性常见的疾病,是由于盆底支持组织薄弱造成的盆腔器官如子宫、阴道等下降移位引发的器官位置及功能异常。虽然PFD不会危及患者生命,但严重影响患者日常生活、活动以及生活质量大幅度下降,对于患者心理健康也造成及其重要的危害。虽然PFD发病的具体作用机制至今不明,但以胶原代谢紊乱为主的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分异常构成PFD的分子及生物学基础。众多研究证明在盆底支持组织如子宫主、骶韧带以及阴道壁组织中胶原含量失衡。盆底支持组织主要是由富含胶原的致密结缔组织组成。以胶原为主的盆底结缔组织具有稳定性和顺应性,能保持阴道的稳定性和可塑性。Ⅰ型胶原与组织牢固程度密切相关,而Ⅲ型胶原与组织的弹性相关。PFD与其他结缔组织病相似,都起源于分子水平的胶原改变。成纤维细胞是盆底结缔组织的主要成分和细胞类型,能够直接对周围的机械刺激环境做出反应,具有机械信号反应性,能分泌胶原等ECM,对保持盆底组织自稳、修复和重建有重要作用。在正常机体中,盆底结缔组织中成纤维细胞调节胶原的合成与分解代谢,二者保持动态平衡。当胶原的合成与分解代谢平衡被破坏,胶原含量以及结构改变,导致胶原功能异常,从而出现一系列病理生理变化,可能导致PFD。因此,盆底成纤维细胞发生胶原代谢紊乱与POP发病密切相关,是在分子生物学水平研究PFD发病机制的基础。由于经历妊娠、分娩等自然的生理过程,女性盆底支持组织处在不断变化的复杂的力学环境中。研究显示孕产次数以及阴道分娩次数是PFD发病的重要危险因素。此外,长期便秘以及重物提举也与PFD发病密切相关。研究显示PFD患者的盆底支持组织和细胞的生物力学特性发生异常改变。PFD的发病与其盆底支持组织受到腹腔内压力增高或直接作用于盆底支持组织的机械挤压相关。尽管证据支持机械力的作用是PFD发病的重要原因,但是联系物理力学与PFD的具体分子机制仍然不清楚。POP患者盆底支持组织呈现高水平的氧化应激(oxidative stress, OS)状态。氧化损伤标志物8-OHdG和4-HNE在POP患者盆底支持组织子宫骶韧带(uterosacral ligament, USL)中含量升高,抗氧化酶GPx1的表达显著降低。上述证据提示OS与POP的发病密切相关。因此,本研究使用人盆底成纤维细胞——人子宫骶韧带成纤维细胞(human uterosacral ligament fibroblast, hUSLF)建立机械力加载模型和氧化应激模型,检测两种模型下胶原代谢的改变,并使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)处理成纤维细胞,观察在抗氧化作用下对胶原代谢的影响。本研究旨在深入研究机械力以及氧化应激在PFD发病中的作用以及二者的相互关系,探索PFD发病的病理生理机制,为临床防治PFD提供理论依据。第一部分机械力在人盆底成纤维细胞胶原代谢中的作用目的：观察机械力作用于hUSLF后,胶原及其代谢相关酶和调节因子的含量变化；探究机械力在PFD发病相关的胶原代谢紊乱中的作用。材料和方法：对因非POP以及SUI良性妇科疾病行子宫切除术的16位患者在术中取USL组织块,对新鲜获取的组织立即行原代培养成纤维细胞,取3～8代细胞进行机械力加载,使用频率0.1 Hz,大小为5333肛(培养板形变量为4 mm)的力作用于细胞4 h。采用实时定量逆转录PCR (qRT-PCR)和Western Blot分别检测I型、III型胶原的含量以及代谢相关的酶MMP-2、MMP-9以及促ECM合成的转化生长因子TGF-β1蛋白的表达情况,使用细胞流式技术检测hUSLF后细胞凋亡情况的变化,用荧光显微镜观察荧光染色后的细胞骨架蛋白F-actin的表达和分布情况,观察hUSLF受到较大的机械负荷后对胶原代谢、细胞凋亡以及细胞骨架的影响,证明机械力负荷与PFD发病的关系。结果：1.机械力作用于hUSLF后,I型、III型胶原含量在mRNA水平(p<0.05)和蛋白水平(p<0.05)均有显著下降。2.机械力作用后,成纤维细胞分泌的降解胶原的酶MMP-2和MMP-9均显著升高(p<0.05),促进胶原合成和稳定的TGF-β1表达量下降(p<0.05)。3. 成纤维细胞凋亡率在机械力负荷后升高(p<0.05)。4.细胞骨架在机械力的作用下,排列规则,但表达量变少,并且骨架蛋白松弛。结论：1. 机械力作用于人盆底成纤维细胞后干扰I型、III型胶原的合成,胶原合成与分解水平失衡,导致胶原含量减少。2.机械力作用下成纤维细胞凋亡水平增加,成纤维细胞数量减少；较大的机械力负荷导致传递和转化机械信号的细胞骨架松弛,骨架蛋白水平降低。3.人盆底成纤维细胞胶原代谢异常与机械力负荷相关。第二部分氧化应激在人盆底成纤维细胞胶原代谢中的作用目的：观察hUSLF处于高水平氧化应激状态下,胶原及其代谢相关酶和调节因子的含量变化；给予氧化应激模型细胞抗氧化剂NAC预处理,进一步探究机体细胞内高氧化应激水平与PFD发病相关的胶原代谢紊乱的关系。材料和方法：同第一部分实验取材以及检测指标,对因非POP以及SUI的良性妇科疾病行子宫切除术的患者在术中取USL组织块,对新鲜获取的组织立即行原代培养成纤维细胞,取3～8代细胞建立高水平氧化应激模型,使用0.4 mM H2O2处理细胞4小时后,检测细胞内氧化应激损伤标志物ROS水平以及8-OHdG含量,鉴定模型是否成功。对氧化应激模型组给予10 mM抗氧化剂NAC预处理,观察在NAC存在或不存在时,对氧化应激模型组细胞进行检测。采用实时定量逆转录PCR (qRT-PCR)和Western Blot分别检测I型、III型胶原的含量以及代谢相关的酶MMP-2、MMP-9以及促ECM合成的转化生长因子TGF-β1蛋白的表达情况,使用细胞流式技术检测hUSLF处于高水平氧化应激水平时细胞凋亡情况的变化,用荧光显微镜观察荧光染色后的细胞骨架蛋白F-actin的表达和分布情况,观察处于高水平氧化应激状态和在氧化应激受到抑制的状态时,hUSLF在胶原代谢、细胞凋亡以及细胞骨架等方面的变化,证明机体的组织和细胞高氧化应激状态与PFD发病的关系。结果：1.鉴定hUSLF的高水平氧化应激模型,检测细胞内ROS水平和8-OHdG含量,与对照组细胞相比,二者水平大幅度升高。2.处于高氧化应激状态的hUSLF.I型、Ⅲ型胶原含量在mRNA水平(p<0.001)和蛋白水平(p<0.01)均有显著下降。3.高水平氧化应激状态的成纤维细胞分泌的降解胶原的酶MMP-2和MMP-9均显著升高(p<0.01),促进胶原合成和稳定的TGF-β1表达量下降(p<0.001)。4.成纤维细胞凋亡率在高氧化应激水平时升高(p<0.001)。5.细胞骨架在细胞处于高氧化应激状态时,排列不规律,表达量变少,并且骨架蛋白松弛。6. 给予抗氧化剂NAC预处理氧化应激模型组细胞后,成纤维细胞内ROS水平和8-OHdG含量大幅度降低,氧化应激状态被抑制。7.给予抗氧化剂NAC预处理氧化应激模型组细胞后,成纤维细胞胶原含量增加(p<0.01),细胞凋亡减少(p<0.01),细胞骨架蛋白表达量升高。结论：1.人盆底成纤维细胞处于高水平氧化应激水平时,抑制Ⅰ型、Ⅲ型胶原的合成,胶原合成与分解水平失衡,导致胶原含量减少。2.高氧化应激状态的成纤维细胞,凋亡水平增加,成纤维细胞数量减少；氧化应激影响传递和转化机械信号的细胞骨架,细胞骨架松弛,骨架蛋白含量降低。3.人盆底成纤维细胞的胶原代谢异常与盆底细胞内高水平氧化应激状态相关。4.当盆底成纤维细胞内氧化应激状态受到抑制后,由高氧化应激水平所引起的细胞内代谢变化得到逆转。第三部分机械力与氧化应激在人盆底成纤维细胞胶原代谢异常中的作用关系目的：对hUSLF的加载模型给予抗氧化剂NAC预处理,与未经NAC预处理的模型组对比,观察NAC预处理后两种模型下,Ⅰ型、Ⅲ型胶原及其代谢相关酶和调节因子的含量变化；研究在与PFD发病密切相关的胶原代谢异常中,机械力负荷与高水平氧化应激状态的作用以及相互关系,探究PFD发病的可能病理生理机制。材料和方法：同第一部分实验取材以及检测指标,对因非POP以及SUI良性妇科疾病行子宫切除术的患者在术中取USL组织块,对新鲜获取的组织立即行原代培养成纤维细胞,取3～8代细胞建立机械力加载模型,在建模前对细胞加10 mM抗氧化剂NAC预处理。应用荧光染色观察细胞内氧化应激损伤标志物ROS以及8-OHdG的含量,采用实时定量逆转录PCR (qRT-PCR)和Western Blot分别检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量以及代谢相关的酶MMP-2、MMP-9以及促ECM合成的转化生长因子TGF-β1蛋白的表达情况,使用细胞流式技术检测hUSLF细胞凋亡情况的变化,用荧光显微镜观察荧光染色后的细胞骨架蛋白F-actin的表达和分布情况,观察hUSLF在胶原代谢、细胞凋亡以及细胞骨架等方面的变化,证明机械力与氧化应激在PFD发病相关的胶原代谢异常中的作用和关系。结果：1.机械力负荷hUSLF后,成纤维细胞处于高氧化应激状态,细胞内氧化应激损伤标志物ROS和8-OHdG水平显著升高。2.抗氧化剂NAC阻止机械力负荷hUSLF后导致的ROS和8-OHdG水平升高。3.抗氧化剂NAC抑制机械力负荷hUSLF造成的I型和III型胶原含量降低(p <0.05)、MMP-2和MMP-9升高(p<0.05)以及TGF-β1表达量下降(p<0.05)。4. 抗氧化剂NAC作用后,机械力加载模型的成纤维细胞凋亡率显著降低(p<0.05)。5.抗氧化剂NAC作用后,机械力加载模型中细胞骨架在表达量升高。结论：1.机械力作用于人盆底成纤维细胞后细胞内氧化应激水平显著升高,呈现高水平氧化应激状态。2.抗氧化剂NAC能有效抑制人盆底成纤维细胞的高氧化应激状态,并且抗氧化剂NAC能大幅度降低承受机械力负荷的人盆底成纤维细胞内的高氧化应激水平。3.抗氧化剂NAC逆转由机械力负荷以及高氧化应激水平造成的I型和III型胶原含量降低、MMP-2和MMP-9升高、TGF-β1表达量下降、细胞凋亡增加以及细胞骨架蛋白表达量减少。4. 外界机械力负荷作用于人盆底支持组织成纤维细胞,诱导细胞内高水平氧化应激状态,造成胶原代谢发生异常,胶原含量降低,进而可能导致PFD的发生。