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目的本研究通过体内体外实验结合血清代谢组学技术研究贻贝多糖（mussel polysaccharideα-D-Glucan,MP-A）对非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的改善作用,并进一步探究其作用机制。方法1、高脂饮食诱导载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout,Apo E-/-)小鼠（C57BL/6J品系）研究MP-A对NAFLD的改善作用:20只正常C57BL/6J小鼠随机分为Normal组和Normal-MP-A组（n=10）,20只Apo E-/-小鼠随机分为高脂饮食（high fat diet,HFD）组和HFD-MP-A组（n=10）。Apo E-/-小鼠喂食高脂饮食诱导NAFLD模型,Normal-MP-A组、HFD-MP-A组连续7周灌胃MP-A（0.8 g/kg）。记录小鼠体重和肝重,测定小鼠血清中甘油三酯（triglyceride,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）的含量,试剂盒法检测小鼠肝脏TG、TC的含量,H＆E染色法观察小鼠肝脏组织形态。RT-q PCR法检测小鼠肝组织中脂质代谢相关基因法尼酯受体（farnesoid X receptor,FXR）、小异源二聚体伴侣受体（Small heterodimer partner,SHP）、脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase,FAS）、胆固醇7a-羟化酶（Cholesterol 7alpha-hydroxylase,CYP7A1）的转录水平。Western blot法检测小鼠肝组织中与脂质代谢相关蛋白FXR、甾醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding protein,SREBP-1C）、FAS、CYP7A1的表达水平。2、采用代谢组学技术分析MP-A对NAFLD大鼠差异代谢物的影响:40只SD大鼠随机分为四组即Normal组、Normal-MP-A组、HFD组和HFD-MP-A组（n=10）。HFD组及HFD-MP-A组大鼠予以高脂饲料喂养诱导NAFLD模型,Normal组及Normal-MP-A组大鼠予以基础饲料喂养。Normal-MP-A组、HFD-MP-A组灌胃MP-A（600 mg/kg）,持续6周。测定大鼠体重、肝重,试剂盒法检测大鼠肝脏TG含量,油红O染色法观察大鼠肝脏组织形态。利用LC-MS技术对大鼠血清进行非靶向代谢组学研究,通过主成分分析、偏最小二乘回归分析法等分析方法及综合筛选条件ratio≥1.2或ratio≤1/1.2、P-value≤0.05、VIP＞1,分析Normal组、Normal-MP-A组、HFD组、HFD-MP-A组血清中代谢物的变化,结合文献分析可由MP-A影响的差异代谢物。3、采用体外细胞实验分析差异代谢物对细胞脂质堆积的改善作用:通过油酸钠诱导人肝癌细胞系（human hepatoellular carcinomas,Hep G2）建立NAFLD体外细胞模型,给予差异代谢物熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid,UDCA）、吲哚-3-丙酸（indole-3-propionic acid,IPA）、吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol,I3C）和甘氨熊去氧胆酸（glycoursodeoxycholic acid,GUDCA）进行干预,同时设立正常对照组。CCK-8法测定油酸钠、UDCA、IPA、I3C和GUDCA溶液对Hep G2细胞存活率的影响。试剂盒法检测Hep G2细胞中TG含量。油红O染色和荧光探针染色后,分别经普通显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞内脂滴积累。Western blot法测定脂质代谢相关蛋白FXR、SREBP-1C及FAS在各组细胞中的表达水平。结果1、MP-A对Apo E-/-小鼠NAFLD的改善作用研究结果:与HFD组比较,HFD-MP-A组小鼠体重增长率和肝重及肝脏指数均显著降低（P＜0.05）。与HFD组比较,HFD-MP-A组小鼠肝脏TG和TC水平显著降低（P＜0.05,P＜0.05）。组织形态学显示MP-A灌胃干预后小鼠肝脏脂质液泡显著减少,说明MP-A可改善高脂饮食诱导的肝组织脂肪变性。与HFD组比较,MP-A可显著降低小鼠肝脏中FAS m RNA的表达水平（P＜0.05）,显著上调CYP7A1 m RNA表达水平（P＜0.05）。与HFD组比较,HFD-MP-A组肝脏中FXR和CYP7A1蛋白表达均显著上调（P＜0.05）,SREBP-1C和FAS蛋白表达均显著降低（P＜0.05）。2、MP-A对NAFLD大鼠差异代谢物的影响分析结果:与HFD组比较,HFD-MP-A组大鼠的体重增长率显著降低（P＜0.05）,肝重和肝脏指数显著降低（P＜0.01,P＜0.05）。给予MP-A后HFD-MP-A组大鼠肝脏TG水平显著降低（P＜0.01）,肝组织冰冻病理油红O染色结果显示,与HFD组相比,HFD-MP-A组肝脏内脂滴沉积显著减少。代谢组学分析结果显示,经MP-A灌胃干预,由高脂饮食诱导的39种代谢物水平变化可趋于Normal组水平。课题组前期研究显示MP-A作为大分子多糖口服吸收生物利用度低,对NAFLD动物的肠道菌群结构具有显著改善作用,我们推测MP-A有可能通过调节肠道菌群影响菌群代谢产物而发挥作用。因此,我们结合文献分析筛选出4种主要由肠道菌群产生而吸收入血的代谢物分别为UDCA、IPA、I3C和GUDCA。在本研究中,NAFLD组血液循环中这4种代谢物含量降低,而经MP-A干预后,这4种代谢物含量升高,有必要进一步分析其对肝脏脂质堆积的作用。3、体外细胞实验分析差异代谢物对细胞脂质堆积的改善作用结果:不同浓度的油酸钠、UDCA、IPA、I3C和GUDCA溶液与Hep G2细胞共同孵育后,经细胞存活率分析,选取50μmol/L的油酸钠作为造模浓度,100μmol/L的UDCA、IPA、I3C和GUDCA作为后续实验的给药浓度。细胞内TG含量测定结果显示,与正常对照组相比,模型组中TG含量显著上调（P＜0.01）;与模型组比较,UDCA、IPA、I3C和GUDCA组细胞内TG含量可显著下调。油红O染色、激光共聚焦显微镜分析结果显示,与模型组相比,UDCA、IPA、I3C和GUDCA组细胞内脂滴聚集显著减少。与正常对照组比较,模型组细胞内FXR蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）,FAS的蛋白表达水平显著上调（P＜0.01）。与模型组比较,UDCA、IPA、I3C和GUDCA组中FXR蛋白表达水平均显著上调（P＜0.05）,SREBP-1C、FAS蛋白表达水平显著下降。结论1、通过高脂饮食诱导的Apo E-/-小鼠和大鼠两种NAFLD动物模型,均表明MP-A可显著改善NAFLD的肝脂肪变性。2、基于代谢组学技术发现MP-A可改善NAFLD模型代谢紊乱,筛选出可被MP-A干预的4种差异代谢物为UDCA、IPA、I3C和GUDCA。与Normal组比较,HFD组中这4种代谢物含量降低,给予MP-A后这4种代谢物含量升高。3、差异代谢物UDCA、IPA、I3C和GUDCA可显著减少油酸钠诱导的Hep G2肝细胞内脂滴堆积,降低胞内TG含量,上调油酸钠诱导的肝细胞内FXR蛋白表达,下调SREBP-1C、FAS蛋白表达。表明MP-A可能通过影响代谢物UDCA、IPA、I3C和GUDCA,进而调控FXR-SREBP-1C-FAS信号通路调节肝细胞内脂质代谢,从而改善NAFLD。