光合细菌PSB-W类胡萝卜素的发酵及生物合成机制初探

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类胡萝卜素属于纯天然色素成分,在食品、化妆品、医疗行业具有良好应用价值。化学合成与植物中提取类胡萝卜素的方法存在局限性,利用微生物发酵类胡萝卜素的研究前景广阔。多种因素对类胡萝卜素的产生和提取有重要影响,目前,对该色素生物合成途径的研究可揭示类胡萝卜素代谢的过程,达到低耗高产的目的。本文从水族净化剂中分离纯化出一株产类胡萝卜素的菌,对菌株进行分离纯化鉴定后研究了菌株高产类胡萝卜素的较优培养条件及提取条件,通过代谢组学技术检测了不同条件对细菌发酵产物的影响,以期为研究类胡萝卜素生物合成机制及开发利用光合细菌产品提供基础理论依据。本文得到的结果有:1.对水族净化剂中菌进行富集培养后,通过四区平板划线分离纯化出一株产类胡萝卜素的菌,采用革兰氏染色法观察了个体形态特征,观察了固液培养基上菌落特征,结果显示:PSB-W是G-菌,在液体发酵培养基中呈深红色、粘稠状菌液,固体培养基上呈红色短杆状圆形菌落,结合生理生化反应及16S rDNA序列的测定后得到该菌株属于紫单孢菌科Proteiniphilum属,与Proteiniphilum acetatigenes的相似度达99%。2.设置了五个不同梯度的培养温度、光照强度及接种量进行单因素试验,得到了Box-Behnken Design水平,根据BBD设计优化了发酵类胡萝卜素的培养条件,得到当温度为29.1℃,光照强度为1643 Lux,接种量为9.43%时PSB-W生产类胡萝卜素量增加,其中类胡萝卜素含量可达8.24 mg/L。3.设置五个梯度乙酸钠浓度添加在培养基中,厌氧发酵4天后测得色素量,结果表明:添加乙酸钠4 g/L时类胡萝卜素量显著提高。配制四种铁盐溶液加入培养基发酵培养,隔一天取样一次测发酵液OD值;对每种铁盐设置五个浓度梯度,分别添加在发酵培养基中厌氧光照4天后提取了发酵液中类胡萝卜素,结果显示:三价铁盐比二价铁更能加快细菌的生长,适宜浓度可提高类胡萝卜素量。FeCl3·6H2O浓度为300μmol/L时获得类胡萝卜素显著增加,NH4Fe(SO42·12H2O浓度为400μmol/L时色素量上升;FeSO4·7H2O浓度200μmol/L时类胡萝卜素显著提高,(NH42Fe(SO46H2O浓度为400μmol/L时类胡萝卜素显著提高。4.对提取类胡萝卜素的三种方式研磨法、酸热法、超声波进行比较后得到超声波浸提得到的类胡萝卜素量显著高于其他方式;设置了五个不同梯度的超声提取时间、超声提取功率及料液比值进行单因素试验,得到了Box-Behnken Design设计水平,根据BBD设计优化了类胡萝卜素的提取,结果为当超声功率为179.9 W、超声时间为5.17 min、料液比为0.8时,类胡萝卜素含量提高,可达8.6 mg/L。5.设置四个发酵培养时间,得到了培养48 h、60 h、72 h、96 h后的发酵液,通过代谢组学方法检测了不同培养时间各样品的代谢产物,采用主成分分析法分析了样品间的差异性,结果显示不同发酵时间处理下样品间差异显著,氨基酸等代谢物的合成在时间上存在阶段性,与细菌的生长阶段相关;设置两种光照强度1000 Lux、1500 Lux培养,得到发酵液,通过代谢组学方法检测了不同光强各样品的代谢物,进行主成分分析、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)筛选出差异代谢物,结合KEGG通路数据库初步得到了生物合成类胡萝卜素过程中的相关代谢物,结果:细菌经戊糖磷酸途径,脂肪酸代谢及甘油磷脂酸的代谢等形成乙酰辅酶A,乙酰辅酶A是形成异戊烯焦磷酸的直接底物,不同光强对乙酰辅酶A的合成影响较大,进而影响到类胡萝卜素的合成。
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