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大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander Ranavirus, CGSRV)属于虹彩病毒科、蛙病毒属,是近年来发现的一种严重危害养殖大鲵的新病原,其感染具有发病率与死亡率高的特点,给大鲵养殖业的健康发展造成了严重威胁,其防控技术已成为人们研究的热点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是利用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)作为序列特异性的触发器,与细胞内同源的mRNA互补配对后再由RNase III家族中能够特异性识别双链RNA的Dicer酶切断,引起生物细胞内同源基因发生降解而表现出该基因特异性沉默的现象,达到阻碍病毒基因顺利表达的目的,起到预防和治疗病毒感染的目的。RNA干扰是生物进化的结果,参与多种真核生物功能,包括病毒防御、基因组重排、染色质重组、干细胞的维持、脑的形态建成以及发育时序决定等。本研究通过化学合成的方法,合成CGSRV病毒主要衣壳蛋白基因(MCP)、甲基转移酶基因(MTase)、DNA多聚酶基因(DNA polymerase)特异的siRNA,把siRNA转染到鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma Papillosum Cyprini,EPC),再进行CGSRV感染。每12h观察一次细胞病变(Cytopathogenic effect,CPE),观察siRNA对病毒增殖情况的影响；应用荧光定量PCR(qRT-PCR)以及病毒滴度测定(TCID50)的方法分别对RNA干扰实验后各基因的相对表达和病毒量及其毒力进行检测分析,从而研究siRNA对CGSRV的影响,以期为大鲵蛙病毒病的防控提供新的技术路线。设计CGSRV病毒的MCP、MTases、DNA polymerase基因特异的siRNA各3-4条及荧光标记的阴性对照(NC-FAM)。使用siRNA-MateTM转染试剂将不同剂量的NC-FAM转染进入EPC细胞,确定优化后的转染浓度为80 nM,转染体积为200μL；接种的CGSRV病毒为1000倍稀释后的病毒悬液,接种体积是150μL。通过每12h对干扰后细胞病变观察与统计结果,确定siR-MCP-3、siR-MCP-4、 siR-MT-1、siR-DP-1和siR-DP-2这5个片段具有更佳的干扰效果,其次是siR-MCP-1、siR-MCP-2、siR-MT-2和siR-DP-3,干扰效果最差的是siR-MT-3。进一步运用荧光定量PCR法对干扰后病毒MCP、MTases DNA polymerase基因的相对表达进行检测分析,分别检测病毒感染后24h、36h、48h、60h、72h、84h各基因的相对表达情况,结果显示：piRNAs干扰后,在不同的检测时间,各基因的相对表达率都有不同程度的下降,MCP基因的最佳干扰率为75%,MTases基因的最佳干扰率为78%,DNA polymerase基因的最佳干扰率为81%。针对各个基因干扰效果最佳的siRNA片段分别是siR-MCP-4,siR-MT-1, siR-DP-1。与此同时,还采用TCID50的方法对干扰后的病毒上清液进行病毒毒力分析。结果显示：针对MCP、MTases、DNA polymerase基因设计的siRNA进行干扰后,CGSRV病毒滴度分别降低了1294倍、1109倍、1000倍。由以上结果可知,本实验所设计的siRNAs对大鲵蛙病毒都具有一定的干扰效果,对MCP、MTases、DNA polymerase基因的表达有一定的抑制作用,在一定程度上降低了病毒毒力,为以后大鲵蛙病毒病的基因治疗方面提供了参考依据。