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实验背景目前冠状动脉支架植入术是治疗冠心病的主要手段,但支架内再狭窄(in-stent restenosis,ISR)和血栓(stent thrombosis,ST)形成是冠状动脉支架植入术后最重要和严重的并发症,其限制了冠心病介入治疗的发展。现临床上最广泛应用的药物洗脱支架虽然通过抑制血管平滑肌细胞过度增殖减少了ISR,但同时也抑制了血管内皮细胞增生,使内皮延迟愈合,导致ST形成。故研发一种既能减少ISR又能减少ST形成的新型冠脉支架一直是医学生物材料领域研究的热点,其具有重大的理论和现实意义。大量的研究发现加速支架植入后的损伤内皮修复,使支架表面早期内皮化可降低ISR和减少ST;前期研究证实CD34抗体支架虽然通过加速内皮化降低了ISR,也减少了ST,但CD34抗原存在着缺少内皮细胞选择性的缺限,在一定程度上促进内膜增生,但不能抑制血管平滑肌细胞增殖,其ISR率仍然较高。实验目的本实验构建一种内载CD34抗体和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)促内皮化,外载依维莫司抑制血管平滑肌细胞增殖的双面涂层冠脉支架,体外实验评价新型双面涂层冠脉支架材料的血液相容性和细胞相容性,体外和体内动物实验评价新型双面涂层冠脉支架抑制平滑肌细胞增殖和促内皮化的作用,获得其防治ISR和ST的临床资料,并探讨应用至临床的可行性。实验方法首先制备载CD34抗体和VEGF的钢片:将多巴胺和肝素进行缩合反应,傅里叶转换红外光谱(fourier transform infrared spectrometer,FTIR)表征;利用聚合多巴胺在支架材料316L不锈钢钢片表面制备涂层基质,表面元素分析(X-ray photoelectron spectrograph,XPS)表征;采用正负相吸层层自组装法在涂层基质上固定CD34抗体和VEGF,制备出载CD34抗体和VEGF的涂层钢片(简称实验组钢片),分别用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)对钢片上固定的CD34抗体和VEGF进行定性、定量表征。然后以裸钢片为对照组,体外评价实验组钢片的生物相容性:通过溶血实验、吸附蛋白种类及数量、血浆凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、激活的部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin,APTT)测定评价了支架涂层材料的体外血液相容性。同时进行了内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)的分离培养和鉴定,二甲基噻唑二苯基四唑溴盐比色法(2methyl thiazole diphenyl tetrazolium bromide salt,MTT比色法)进行了体外毒理即细胞相容性评价;通过在材料表面培养EPC,流式细胞仪测定最终材料表面内皮细胞(endothelial cell,EC)的数量,评价材料对EPC分化增殖能力的影响。再采用支架外层封闭保护法构建内载CD34抗体和VEGF、外载依维莫司的双面涂层冠脉支架(简称实验支架),同时制备裸金属支架(简称NIR支架)、依维莫司支架、CD34抗体和VEGF涂层支架(简称单面支架)。最后制备猪冠状动脉损伤模型,动物体内实验评价了四组支架对内膜增生和内皮化的影响:定量冠状动脉造影(quantitative coronary angiography,QCA)比较了各组支架在4周及12周时直径狭窄百分数(Percentage of Diameter Stenosis,%DS),光镜下比较了各组植入支架的冠状动脉标本在4周及12周时内膜增生情况、内皮化程度及面积狭窄百分数(percentage of area stenosis,%AS)。实验结果聚多巴胺联合层层自组装法在钢片表面担载了CD34抗体、VEGF:FTIR证实了肝素和多巴胺缩合成功;XPS证实了钢片表面聚多巴胺膜形成;CLSM、ELISA分别定性、定量证实了钢片表面的CD34抗体及VEGF固定。体外评价证实实验组钢片具有良好的血液相容性:溶血率合格;与裸钢片比较,实验组钢片吸附白蛋白增多,且有差异(P<0.05);APTT延长,且有差异(P<0.05)。体外评价证实实验组钢片具有良好的细胞相容性:MTT法结果示实验组钢片上EPC生长数量明显多于裸钢片组,且有差异(P<0.01)。体外评价证实实验组钢片促进EPC分化、增殖为EC:流式细胞仪结果示实验组钢片表面分化成熟的EC表面特异性标记CD31、KDR多于裸钢片组,且有差异(均为P<0.05)。动物体内实验证实,实验支架减少支架表面的新生内膜增生,加速内皮化,各组在4周及12周时%DS结果示:在两个时间点上,均是NIR支架组%DS最大,与其余三组差别较大;单面支架组次之;实验支架组最小,其与单面组有差异(P<0.05);4周时实验支架组与依维莫司支架组差异不显著(P>0.05),但12周时实验支架组与依维莫司组差异显著(P<0.05);%DS组内比较时发现,仅实验组的%DS在4周和12周时相比无统计学差异,其余三组两个时间点的%DS比较均有差异(P<0.05)。通过光镜下观察各组在4周及12周时内膜增生情况并比较%AS结果示:实验支架组及依维莫司支架组与NIR支架组和单面支架组相比可以明显减少内膜增殖(P<0.05),4周时实验支架组与依维莫司支架组无差异(P>0.05),但12周时实验支架组较依维莫司支架组和单面支架组内膜增生更少(P<0.05),光镜下观察发现实验支架组表面内皮化厚度及分布更均匀;%AS组内比较发现,单面组和实验组的%AS在4周和12周时相比无差异(P>0.05),其余两组两个时间点的%AS比较均有统计学差异(P<0.05)。实验结论内载CD34抗体和VEGF、外载依维莫司的双面涂层冠脉支架具有良好的体外生物相容性,可促进EPC分化增殖为EC,并减少支架表面的内膜增生,加速内皮化,并且在4周内即出现较好的治疗效果。本实验为防治ISR和ST提供了坚实的理论基础和充分的实验依据。实验意义及应用价值目前国内外尚无利用CD34抗体和VEGF共同促内皮化,同时利用依维莫司抑制平滑肌细胞增殖来最大限度地防治ISR和ST的冠脉支架报道。本实验构建的内载CD34抗体和VEGF、外载依维莫司的双面涂层冠脉支架为解决ISR和ST的瓶颈问题提供很好的解决思路,可以明显减少冠状动脉支架植入后并发症、充分改善患者的预后、大大提高冠心病患者的治愈率和生存率。同时新型冠脉支架的应用可以减少冠心病患者的心脏事件和再次冠脉血运重建的可能,这对节约国家医疗卫生资源意义重大,可带来巨大的经济和社会效益。此外,本实验为国产高性能的新型冠脉支架的临床开发应用提供理论基础和实验依据,对临近学科如外科血管修复材料的研制有很大借鉴意义,这对生物医学植入材料领域的科技进步、产业结构的升级及医用冠脉支架的更新换代作用显著。