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目的:白血病宿主骨髓微环境有利于白血病细胞增殖而不利于正常造血,其炎性转变是重要原因,部分白血病宿主骨髓炎性因子及野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)基因明显升高,既往研究证实浙贝黄芩汤通过降低Wip1抑制白血病细胞增殖并改善炎性反应,提示骨髓炎性微环境参与浙贝黄芩汤抑制肿瘤增殖的过程。本课题以B细胞淋巴瘤患者为回顾性临床研究对象,初步探讨血清炎性因子IL-6与淋巴瘤疗效的相关性;另以L1210淋巴细胞白血病小鼠模型为研究对象,通过细胞生物学及分子生物学等技术,进一步证实白血病状态下骨髓炎性因子的表达明显升高,以浙贝黄芩汤为干预措施,观察小鼠白血病负荷、骨髓及血清炎性因子IL-6、TNF-α、Wip1mRNA的表达变化,阐释浙贝黄芩汤促进炎性因子的消除以改善骨髓炎性微环境的作用。通过明确浙贝黄芩汤对白血病骨髓炎性微环境的影响,尝试寻求中医药治疗白血病与淋巴瘤的新靶点。方法:1.回顾性临床研究:初步探讨血清炎性因子IL-6与淋巴瘤疗效的相关性,探索浙贝黄芩汤治疗的优势人群。选取2013年1月至2018年12月在北京中医药大学东直门医院血液肿瘤科住院的非霍奇金淋巴瘤患者为研究对象,纳入标准:①确诊为非霍奇金淋巴瘤B细胞来源;②治疗方案:口服浙贝黄芩汤联合2周期标准化疗;③治疗前及2周期化疗后均检测血清IL-6;④检测血清IL-6前一周内未合并感染性疾病;⑤治疗2周期后有疗效评价。分析血清炎性因子IL-6的变化趋势是否可以预测淋巴瘤疗效。2.造模:应用BALB/c小鼠制备L1210白血病模型。5-6周龄雄性BALB/c小鼠,经尾静脉接种对数生长期L1210细胞1×107个/只。接种前及接种第10天经尾静脉取外周血进行全血细胞分析、血涂片白细胞分类,鉴定小鼠急性淋巴细胞白血病模型。3.分组给药:以L1210白血病模型鼠为研究对象,浙贝黄芩汤为干预措施。造模成功后将动物模型随机分组,每组6只:模型组、中药组、正常组。中药组予浙贝黄芩汤灌胃(依据小鼠折算系数8.65倍,折算后浙贝黄芩汤浓度为13.30ml/kg),正常组与模型组予等体积蒸馏水灌胃,每次0.20ml,1天1次,连续15天。4.观察指标:观察白血病小鼠生存状态、存活时间,分组给药前、给药第8天采集尾静脉取血检测血常规,第15天或濒死前处死动物,眼眶取血,检测血常规,制备外周血涂片,ELISA方法检测骨髓及血清炎性因子IL-6、TNF-α,RT-qPCR检测骨髓及外周血Wip1mRNA,肝脾肾组织病理切片HE染色观察组织的结构和细胞形态,探讨浙贝黄芩汤对白血病小鼠炎性因子及组织病理改变的影响。结果:1.浙贝黄芩汤联合化疗2周期后淋巴瘤患者血清IL-6升高,疾病进展组血清IL-6较治疗前明显升高具有统计学意义(P<0.05),血清炎性因子IL-6过高可能提示淋巴瘤不良转归,可进行大样本研究进一步证实。①共纳入符合要求的B细胞来源非霍奇金淋巴瘤患者14例,中位年龄65岁。侵袭性淋巴瘤9例,非侵袭性淋巴瘤5例。②血清IL-6表达水平与性别、中位年龄、侵袭性、Ann-Arbor分期、IPI评分无关。③治疗后血清IL-6明显升高:治疗前血清IL-6浓度为(8.50±6.90)pg/mL,治疗后为(24.66±27.28)pg/mL,治疗后较治疗前明显升高(P<0.05)。④按临床疗效分组比较IL-6变化趋势。治疗获益组包括缓解者4例、稳定者3例;疾病进展组7例。获益组、进展组治疗前血清IL-6浓度分别为(7.58±4.06)pg/L、(9.41±8.79)pg/L,基线水平一致;治疗后获益组、进展组血清 IL-6 浓度为(25.54±31.38)pg/L、(26.77±22.24)pg/L。两组间血清IL-6浓度变化无明显差异,但进展组治疗后血清IL-6浓度较治疗前明显升高(P<0.05)。治疗获益组中,缓解者、稳定者治疗前血清IL-6浓度分别为(8.10±3.19)pg/mL、(6.89±4.91)pg/mL,治疗后为(14.39± 15.36)pg/mL、(33.41±42.16)pg/mL。两者血清IL-6浓度变化无明显差异。疾病进展组血清IL-6较治疗前明显升高,可能提示淋巴瘤不良转归,有待于进行大样本研究进一步证实。2.成功建立L1210白血病小鼠模型。18只SPF级雄性BALB/c小鼠,随机分为3组,每组6只,分别为模型组、中药组、正常组。模型组和中药组小鼠经尾静脉接种对数生长期L1210细胞1×107个/只,正常组小鼠经尾静脉注射等体积的生理盐水。造模后第10天,尾静脉取血制备血涂片,模型组和中药组小鼠外周血涂片均可见原始及幼稚淋巴细胞,外周血白血病细胞比例模型组小鼠为(10.67±1.57)%,中药组为(10.83±1.91)%,两组无明显差异(P>0.05)。正常组外周血无异常淋巴细胞。3.浙贝黄芩汤明显改善L1210白血病小鼠生存状态,降低白血病负荷,明显减少肿瘤浸润,有助于防治肿瘤性贫血。①生存状态:造模后小鼠均萎靡不振、喜静恶动,竖毛无光、体重下降,逐渐出现脊背弓起、步态不稳,模型组个别小鼠腹部及尾部出现硬结,二便失禁。中药组与模型组相比,接受浙贝黄芩汤干预的中药组小鼠在进食量、精神、活动方面有所改善,出现死亡时间晚于模型组。②体重变化:各组小鼠的体重随时间变化而逐渐增长,中药组体重增长幅度优于模型组,分组第15天,模型组、中药组、正常组体重分别为(23.42± 1.21)g、(23.95± 1.07)g、(25.72±0.84)g。③全血细胞分析:模型组、中药组、正常组白细胞计数分别为(9.36±1.75)×109/L、(9.11±0.70)× 109/L、(6.92±0.91)×109/L,淋巴细胞计数分别为(6.38±0.78)×109/L、(5.77±1.49)× 109/L、(2.55±1.33)×109/L,模型组与中药组白细胞及淋巴细胞计数均较正常组明显升高(P<0.05);中药组白细胞及淋巴细胞计数虽低于模型组,但差异无统计学意义。模型组、中药组、正常组血红蛋白值分别为(140.25±31.20)g/L、(163.25±14.10)g/L、(162.83±4.91)g/L。与正常组相比,中药组血红蛋白无下降,但模型组下降20g/L。④外周血白血病细胞比例:模型组小鼠外周血白血病细胞比例为(18.50±2.29)%,中药组小鼠为(15.83±0.69)%,中药组外周血白血病细胞比例低于模型组(P<0.01)。⑤脾脏、肝脏病理:模型组、中药组、正常组脾脏重量分别为(0.12±0.01)g、(0.09±0.01)g、(0.09±0.02)g,模型组及中药组小鼠脾脏都有不同程度的肿胀,均可见到肿瘤浸润坏死灶。中药组脾脏重量明显低于模型组(P<0.05),且脾脏肿胀程度轻,肿瘤浸润灶少,坏死灶也少于模型组。各组肝脏重量无显著差异,模型组及中药组肝脏组织结构均有破坏,模型组肝脏表面可见多个灰白色浸润灶、坏死灶,中药组肝脏表面粗糙、肿瘤浸润灶数量及面积均少于模型组。结果显示浙贝黄芩汤可以减轻白血病负荷,减少肿瘤浸润,有助于防治肿瘤性贫血。4.L1210白血病小鼠骨髓微环境IL-6、TNF-α、Wip1mRNA的表达明显升高,浙贝黄芩汤可明显降低骨髓及血清IL-6、TNF-α,但未降低骨髓Wip1mRNA的表达。①血清IL-6、TNF-α表达量:模型组、中药组、正常组小鼠血清IL-6表达量分别为(45.47±12.88)ng/L、(23.91±7.44)ng/L、(26.73±2.15)ng/L;血清TNF-α表达量分别为(65.79± 19.77)ng/L、(36.65±15.88)ng/L、(38.68±8.79)ng/L。中药组血清 IL-6、TNF-α表达均明显低于模型组(P<0.05),与正常组基本持平。②骨髓IL-6、TNF-α表达量:骨髓IL-6表达量,模型组、中药组、正常组分别为(56.33±20.73)ng/L、(21.34±5.08)ng/L、(27.40±3.59)ng/L;骨髓 TNF-α 表达量分别为(40.66±14.47)ng/L、(24.17±2.94)ng/L、(18.49±2.97)ng/L。中药组骨髓 IL-6、TNF-α 表达均明显低于模型组(P<0.01)。③探索炎性因子与Wip1mRNA表达水平的相关性:模型组、中药组、正常组的骨髓Wip1mRNA相对表达量分别为(5.88±6.32)、(3.96±1.95)、(1.00±0.56)。模型组与中药组骨髓Wip1mRNA表达量均高于正常组(P<0.05),但中药组与模型组骨髓Wip1mRNA表达量之间无明显差异(P>0.05),骨髓Wip1与炎性因子的表达量未显示出相关性。结论:淋巴细胞白血病状态下小鼠骨髓炎性因子的表达明显升高,浙贝黄芩汤可以改善淋巴细胞白血病小鼠的骨髓炎性微环境以减轻肿瘤负荷。