小麦是世界上最重要的粮食作物之一,是我国第二大粮食作物。看麦娘（Alopecurus aequalis Sobol.）是一种恶性禾本科杂草,广泛分布于我国东部、中南部、西南部以及黄河流域部分地区的稻茬麦田,严重影响小麦的产量。甲基二磺隆是一种乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂类除草剂,自上市以来,广泛用于防治看麦娘等麦田杂草。然而,由于其作用位点单一以及长期大量重复使用,看麦娘已经对其产生了抗药性。调查表明,江苏、安徽等省份多个地区麦田看麦娘在甲基二磺隆大田推荐剂量下已经无法得到有效防控,某些种群甚至对不同作用机制的除草剂同时产生了抗药性,严重威胁农业可持续发展。本研究在看麦娘发生严重的江苏、安徽、河南、山东四个省份共采集80个种群,测定了其对甲基二磺隆的敏感性,并对代谢抗性表型最为明显的种群AH-18进行了详细的抗性机制研究,主要结果如下:1.采用整株水平测定法,应用甲基二磺隆大田推荐剂量(9 g a.i.ha-1)对所有看麦娘种群进行抗性初筛,共鉴定到JS-03、JS-08、JS-10等36个敏感种群和JS-01、JS-02、JS-06等44个抗性种群。对部分抗性种群进行抗性水平测定,结果表明,相比敏感种群,抗性种群的抗性倍数在12.75～225.90之间,均为高水平抗性。2.靶标基因测序结果表明,所有抗性种群ALS基因均发生了突变,其中42个种群ALS1基因发生了突变,而ALS2基因未发生任何变化,包括:JS-01、JS-02、AH-04等28个种群ALS1基因第574位由Trp突变为Leu;AH-12和AH-36种群ALS1基因第197位由Pro突变为Tyr,该突变形式是首次在看麦娘物种中得到鉴定;AH-18、JS-04和JS-05种群ALS1基因第197位由Pro突变为Arg;AH-27、AH-29和AH-52种群ALS1基因第197位由Pro突变为Ser;JS-06、JS-07、JS-09、AH-15、AH-46、AH-51和SD-03种群ALS1基因第197位由Pro突变为Thr。其中,AH-29种群不同植株ALS1基因发生了2种突变,即第574位由Trp突变为Leu或第197位由Pro突变为Ser。AH-14和AH-32种群ALS1基因未发生任何已知突变,而ALS2基因分别发生了Trp-574-Leu和Pro-197-Thr突变。说明所有抗性种群均对甲基二磺隆产生了靶标抗性。3.采用整株水平测定法,测定了具有新颖ALS基因Pro-197-Tyr突变纯合型看麦娘种群AH-36对其它除草剂的敏感性。结果表明,相比敏感种群,AH-36对甲基二磺隆、啶磺草胺和氟唑磺隆产生了高水平抗性,对咪唑乙烟酸和嘧草硫醚产生了中等水平抗性,其抗性倍数在7.8～28.5之间。然而,AH-36种群对光合作用抑制剂异丙隆依旧敏感,大田推荐剂量(900 g a.i.ha-1)下室内防效达100%。4.采用q RT-PCR技术测定了敏感种群SD-01和抗性种群AH-18 ALS基因在甲基二磺隆处理前后的表达变化。结果表明,甲基二磺隆处理能够诱导看麦娘ALS基因的表达;相比SD-01,AH-18 ALS基因转录水平在药剂处理前后均显著上调。5.在整株水平上测定了P450s抑制剂马拉硫磷在看麦娘种群对甲基二磺隆敏感性中的影响。结果显示,马拉硫磷预处理显著增加了JS-05、AH-15、AH-18、AH-29、AH-36共5个种群对甲基二磺隆的敏感性,其中对AH-18种群敏感性影响最为显著。说明P450s能够介导看麦娘对甲基二磺隆的代谢作用。6.采用整株水平测定法测定了P450s抑制剂马拉硫磷对看麦娘抗性水平的影响。结果显示,马拉硫磷预处理后,甲基二磺隆对抗性种群AH-18的GR50值降低了41%,而对敏感种群SD-01的GR50值无显著变化。说明P450s活性增强显著提高了抗性种群AH-18对甲基二磺隆的代谢作用。7.分别测定了敏感种群SD-01和抗性种群AH-18以CDNB为底物的GSTs活性。结果表明,2个种群GSTs活性均可以被甲基二磺隆所诱导,而且在药剂处理前后,AH-18的GSTs活性均显著高于SD-01。说明GSTs也能够介导看麦娘对甲基二磺隆的代谢作用,且抗性种群AH-18的GSTs活性显著增强。8.采用LC-MS/MS测定了敏感种群SD-01和抗性种群AH-18在甲基二磺隆处理后第1、3、5、7 d看麦娘植株的除草剂残留量。结果显示,在药剂处理后各个时间点,相比SD-01种群,AH-18种群植株甲基二磺隆含量更低,即甲基二磺隆代谢速率更快。进一步证明了抗性种群AH-18存在显著的代谢抗性。9.利用转录组测序技术,以纯化的敏感种群SD-01和抗性种群AH-18为研究对象,挖掘与甲基二磺隆代谢抗性相关候选基因,并通过荧光定量PCR初步验证基因差异表达结果。结果表明,共有4个P450s、2个GSTs、2个GTs、2个ABC transporters以及其它7个与氧化、水解、植物胁迫生理相关的基因可能与AH-18对甲基二磺隆的代谢抗性有关。10.利用蛋白组定量技术,以纯化的敏感种群SD-01和抗性种群AH-18为研究对象,挖掘与甲基二磺隆代谢抗性相关候选蛋白,并通过靶向定量蛋白组学对差异表达结果进行初步验证。结果表明,共有1个酯酶、4个GSTs、2个GTs、3个ABC transporters以及其它12个与氧化、过氧化、还原等过程相关的酶可能与AH-18对甲基二磺隆的代谢抗性有关。11.对转录组学和蛋白组学结果进行关联分析,综合考虑不同组学测序深度差异、基因表达水平及其功能学意义等,初步选择8个基因进行转基因拟南芥功能验证。结果显示,在5 nmol L-1甲基二磺隆剂量下,转CYP709C56、GSTF1和GSTU1的株系均表现出显著的甲基二磺隆耐药性,且其敏感性与转基因转录积累水平相关。12.采用原核表达系统获得GSTU1活性蛋白,并进行酶活测定。结果显示,GSTU1存在以甲基二磺隆为底物的催化活性,表明该基因确实参与了看麦娘对甲基二磺隆的代谢抗性。综上所述,本研究明确了我国主要稻茬麦田耕作区看麦娘对甲基二磺隆的抗性发生发展程度。抗性机理研究结果表明,所有初筛后的抗性种群均对甲基二磺隆产生了靶标抗性,其中部分种群同时对其产生了代谢抗性。以代谢抗性表型最为明显的AH-18种群为研究对象,证明其代谢抗性与增强的P450s、GSTs等解毒酶活性所导致的更快的除草剂代谢速率有关。通过组学关联分析、荧光定量PCR、靶向定量蛋白组学、转基因拟南芥等技术,鉴定到3个在看麦娘对甲基二磺隆代谢抗性中起关键作用的基因,并对关键基因之一的GSTU1进行了原核表达和蛋白解毒能力分析。本研究所鉴定到的关键基因能为抗性杂草诊断和作物遗传育种提供潜在基因资源,并为解析杂草对特定除草剂的代谢抗性机理提供一定借鉴。