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研究背景树突状细胞自然杀伤细胞凝集素家族受体1(DC NK lectin group receptor-1,DNGR-1)又称为C型凝集素结构域家族9成员A(C-type lectin domain family 9 member A,CLEC9A),属于II型跨膜蛋白,为C-型凝集素受体家族成员之一。DNGR-1的表达具有高度的DC选择性,其配体是死亡和受损细胞暴露的纤维状肌动蛋白(Filament actin,F-actin)。DNGR-1参与DC的内吞功能,与交叉呈递死亡细胞和肿瘤相关抗原、启动细胞和体液免疫应答有关,在肿瘤疾病的预防和治疗,以及抗病毒感染中具有重要的作用。目前,DNGR-1的研究主要集中在人和小鼠DNGR-1结构、功能以及在诱导肿瘤和病毒特异免疫应答中的作用等方面。人DNGR-1分子主要表达在BDCA3+(CD141+)DC表面,小鼠DNGR-1主要表达在CD8α+DC表面,都与DC抗原交叉呈递功能有关。但人与小鼠的DNGR-1在胞质区的ITAM样结构、剪切异构体数目以及是否以二聚体或单体形式表达等方面不同,而且人DNGR-1和小鼠Dngr-1基因的核苷酸和氨基酸序列的相似性较低。恒河猴与人类亲缘关系较近,是疫苗和人类疾病研究的重要动物模型。为更好地利用恒河猴研究DNGR-1在艾滋病病理过程中的作用及其在艾滋病疫苗创制中的应用前景,本研究克隆表达了恒河猴DNGR-1基因,阐述了其分子特性、细胞和组织分布以及HIV/SIV感染对不同组织中DNGR-1表达的影响。为深入研究DNGR-1的相关人类疾病及探索艾滋病靶向治疗方法提供必要的科学基础。研究方法1、建立RT-PCR和RACE方法扩增恒河猴DNGR-1cDNA全长序列,用Bioedit(ClustalW)和MegAlign(ClustalW)软件对编码区核苷酸和氨基酸序列进行比对,并用MEGA6.0构建系统发生树。2、构建恒河猴DNGR-1分子胞外端C型凝集素样结构域(C-type lectin-like domain,CTLD)的原核表达质粒,在BL21(DE3)大肠杆菌中表达目的蛋白,纯化、复性后免疫新西兰大白兔制备抗恒河猴DNGR-1抗体。同时构建恒河猴DNGR-1真核表达质粒,转染HeLa细胞用于体外粘附实验。3、采用去除血清、自然凋亡和多聚甲醛固定并透化等方法诱导细胞凋亡及细胞膜损伤,PMA和LPS刺激THP-1细胞焦亡,流式细胞术和免疫荧光方法进行配体结合实验。4、利用巢氏PCR和实时荧光定量PCR检测组织中DNGR-1mRNA的表达水平;利用Western Blotting检测组织中DNGR-1蛋白水平;采用TSA信号放大系统进行免疫荧光染色,激光扫描共聚焦显微镜观察组织中DNGR-1+细胞的分布。5、利用实时荧光定量PCR检测SHIV/SIV感染的恒河猴血液(感染后不同时间点)、肠道、淋巴结等组织和HIV感染者血液中的DNGR-1mRNA水平。同时采集HIV/SIV感染后的血液进行DNGR-1配体结合实验。研究结果1、获得了长度为1270bp的恒河猴DNGR-1cDNA核苷酸序列。DNGR-1编码区、5’非编码区(5’-untranslated region,UTR)和 3’-UTR序列分别为 726bp,124bp 和 420bp。该基因位于第11号染色体,对应在中国恒河猴基因组中的序列为15739bp,编码区包含6个外显子。推测的DNGR-1分子包括胞质区、跨膜区、颈部区和CTLD。恒河猴DNGR-1基因编码区核苷酸和推测的氨基酸序列与GenBank中已有序列(截至2015年)的相似性分别为71.3%-99.3%和54.4%-99.2%,与灵长目动物的相似性最高,与啮齿类动物的相似性最低。构建的系统进化树中,恒河猴DNGR-1与猴科的关系最近,位于同一分支;与人科的关系比较近;与啮齿类等动物的关系比较远,位于不同的分支。2、成功表达了恒河猴DNGR-1的CTLD区,获得了重组DNGR-1CTLD蛋白。恒河猴DNGR-1 CTLD与人的抗原性相似,基于该蛋白制备的抗恒河猴DNGR-1抗体可以用于组织中DNGR-1+细胞的检测。重组CTLD蛋白具有生物学活性,能够识别原代细胞(血液及PBMC)和传代细胞系细胞(HeLa和293T等)中的凋亡和死亡细胞。此外,重组CTLD蛋白还可以结合焦亡的THP-1细胞。HeLa细胞表面表达重组恒河猴DNGR-1蛋白后可以粘附凋亡的MT-4和恒河猴PBMC。3、发现DNGR-1基因在恒河猴大部分组织中均有表达。淋巴结、脾脏和血液中的表达水平较高;胃肠道、肺脏、扁桃体等组织的表达水平较低;皮肤、肌肉、脑(大脑、小脑和脊髓)和心血管系统(心脏、动脉)、气管和骨髓中的表达水平最低。观察到表达DNGR-1(DNGR-1+)的细胞,它们存在于空回肠中段和结肠近端的固有层,腹股沟淋巴结的皮质区和髓质区的交界处,脾脏组织的白髓边界、红白髓交界及边缘区(数量极少),尚未在胸腺和胃底组织中观察到DNGR-1+细胞。4、观察了DNGR-1mRN 水平在免疫缺陷病毒感染后的变化。恒河猴感染SHIV/SIV后,血液中DNGR-1mRNA水平随感染时间的变化而变化。第一次(SHIV-sf162p4直肠)攻毒后的第41d(P=0.0317)、第二次(SHIV-sf162p4静脉)攻毒后的第4d(P=0.0159)、第11d(P=0.0079)、第98d(P=0.0205)和第三次(SIVmac251静脉)攻毒后第4d(P=0.0483)、第 11d(P=0.0317)、第 182d(P=0.0125),血液中 DNGR-1mRNA 水平均较攻毒前显著降低(Mann-Whitneytest),感染后75周的转录水平与正常动物水平相近。整个感染过程中,第二次和第三次攻毒后的前期(约11d),血液中DNGR-1mRNA水平最低,随后逐渐升高至正常动物水平后又降低,第三次感染后期(实验终止前)再次升高至正常动物水平。感染后75周,肠道、淋巴结、PBMC和血液中的DNGR-1转录水平出现升高趋势,其中结肠近端、肠系膜淋巴结和PBMC中的转录水平显著高于正常动物(P=0.0079,P=0.0317和P=0.0159)。人感染HIV(约3年)后,血液中DNGR-1mRNA水平较正常人明显降低,而且抗逆转录病毒治疗(Antiretroviral Therapy,ART)后DNGR-1mRNA水平显著降低(P<0.0001),与病毒耐药与否无关。某些HIV感染者血液中DNGR-1mRNA水平可能与病毒载量和CD4+T细胞数量具有负相关性。5、观察了免疫缺陷病毒感染血液中DNGR-1识别细胞的变化。重组CTLD蛋白可以识别SIV/HIV感染血液中的凋亡和死亡细胞。恒河猴感染SIV后,重组CTLD蛋白结合细胞水平降低,而经过ART的HIV感染者的DNGR-1识别细胞水平升高,识别凋亡细胞的百分数和能力取决于血液中发生凋亡细胞的比例和病毒感染后血液中处于不同时期的凋亡细胞水平。结论本研究首次获得了恒河猴DNGR-1cDNA的核苷酸序列,发现与人的DNGR-1基因和结构高度相似,能够编码与人抗原性相似的蛋白质。恒河猴DNGR-1基因在大部分组织中均有表达,不同组织中的DNGR-1mRNA水平不同,肠道(空回肠中段和结肠近端)和淋巴结(腹股沟淋巴结)组织中存在表达DNGR-1的细胞。重组恒河猴DNGR-1胞外区CTLD蛋白具有生物活性,能够结合不同类型的凋亡和焦亡细胞。免疫缺陷病毒感染能够影响DNGR-1基因的转录水平。重组CTLD蛋白能够结合SIV/HIV感染血液中的凋亡细胞,DNGR-1识别细胞水平在SIV感染个体血液中降低,在经抗逆转录病毒治疗的HIV感染者的血液中升高,识别凋亡细胞的百分数和能力与凋亡细胞的比例及处于不同时期的凋亡细胞水平有关。本研究表明恒河猴DNGR-1与人的高度相似,恒河猴作为动物模型的研究成果更易于向AIDS和肿瘤等疾病的预防、治疗和临床应用转化,免疫缺陷病毒感染对DNGR-1基因的表达具有显著影响,抗逆转录病毒治疗未能使其恢复至正常水平,需要在AIDS治疗疫苗研究中得到重视。