论文部分内容阅读
在免疫系统中,主要组织相容性复合物（Major histocompatibility complex,MHC）Ⅰ、Ⅱ分子作为肽受体,具有提呈抗原肽的功能。恒定链（Invariant Chain,Ii）是一种非多态性Ⅱ型跨膜糖蛋白,它是MHCⅡ分子生物合成及MHCⅡ分子结合外源性抗原肽过程中重要的分子伴侣。研究表明,在内质网中Ii辅助MHCⅡ亚单位初始折叠和低聚化,并与MHCⅡ分子组装成（αβIi）3九聚体,同时Ii的CLIP区（the class-Ⅱassociated Iichain peptide）即第81-104位氨基酸片段,占据MHCⅡ的抗原结合凹槽,有效屏蔽了MHCⅡ类分子在内质网中与内源性抗原肽结合。细胞中缺乏Ii会导致MHCⅡα链和β链不能正确折叠,从而被较长时间滞留于内质网中。迄今为止,Ii与MHCⅡ分子相互关系的研究多集中在哺乳动物,有关禽类的研究还未见报导。从推测的氨基酸序列分析看,人、小鼠、大鼠的CLIP区（尤其是91-99aa:MRMATPLLM）是完全保守的,但这种高度的保守性未出现包括禽类在内的其他物种中。对于鸡Ii与鸡Ⅱ类抗原递呈分子亚单位在细胞中的定位如何,Ii链能否与MHCⅡα和MHCⅡβ的单链聚合,Ii链中的CLIP区在聚合中起何作用,外源性抗原肽替代CLIP后,Ii链是否还能与MHCⅡ链聚合?为了探讨这些问题,我们构建了表达红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein,RFP）的鸡Ⅱ类抗原递呈分子亚单位即MHCⅡα链和β链的真核表达载体和表达增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluores cenceProtein,EGFP）的Ii真核表达载体,使用瞬时表达系统,检测Ii与单个MHCⅡ亚单位在COS-7细胞中的表达和定位,并通过免疫共沉淀进一步研究它们之间的相互关系。研究表明,带有荧光蛋白的融合蛋白保持了目的蛋白（Ii、MHCⅡα和MHCⅡβ）的活性和标记蛋白（GFP和RFP）的特性且定位于细胞的内膜系统;其次鸡Ii链与单链MHCⅡα或MHCⅡβ之间存在细胞内的共定位,并且它们之间能够形成复合体,在这一过程中CLIP区担当关键角色。为了探索研制高效的核酸疫苗,我们将以新城疫病毒的F343抗原表位基因（aa327-359）替换鸡Ii链CLIP编码基因构建的Ii嵌合体分别与单个MHCⅡ亚单位共转染COS-7细胞,通过荧光显微镜观察Ii嵌合体改变了抗原表位在细胞中的定位,并且通过免疫共沉淀证实用NDV的F343抗原肽取代CLIP区的Ii嵌合体保持与单链MHCⅡα或MHCⅡβ聚合。这些结果提示,只要保持Ii分子基本的空间结构,Ii链就能与MHCⅡα或MHCⅡβ链形成聚合体。因此,在新型高效基因疫苗的设计中,Ii可以充当抗原肽潜在的运输载体将抗原肽靶向性地传递到MHCⅡ递呈抗原分子的路径中。病毒性抗原作为内源性抗原由MHCⅠ类分子呈递,而Ii分子作为MHCⅡ分子的伴侣蛋白主要协助递呈外源性抗原。MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子的合成均起源于内质网,它们在细胞中的分选则发生在高尔基体的反面膜囊,MHCⅠ类分子通过膜泡运输离开高尔基体到达细胞表面,MHCⅡ类分子则进一步到达溶酶体。MHCⅠ与MHCⅡ所走路线的不同可能与Ii的引导有关。为了了解鸡的Ii分子与MHCⅠ类分子之间的关系,本文还探讨了它们之间是否存在相互作用。为此,我们首先获得了鸡MHCⅠ分子亚单位的基因,并进一步构建了相应的原核表达质粒,用pET-32a和Rosseta菌组合表达带有信号肽的MHCⅠα、MHCⅠβ2m。其次,我们构建了能表达红色荧光蛋白的鸡MHCⅠ类抗原递呈分子亚单位的真核表达载体,并与能表达增强型绿色荧光蛋白的Ii真核表达载体,使用瞬时表达系统共转染COS-7,荧光显微镜检测与免疫共沉淀的结果表明,单个的鸡MHCⅠα重链或β2m轻链均不能与鸡Ii有效结合,Ii分子要求与完整的MHCⅠ分子结合才能形成复合体。