花青苷是植物体中重要的次生代谢物,是一种黄酮类化合物。是一种天然的植物色素,遍布于植物的多种组织器官中,在植物生长发育中起着重要作用,也是决定着果实色泽的主要色素,具有预防心血管疾病,抗氧化,抗衰老等作用,对人体健康有很大好处。其生物合成途径受到许多外在因素的影响,如温度,光照,植物激素和糖等。MYB、bHLH、WD40和DELLA蛋白等是主要参与调控花青苷生物合成的转录因子。WRKY作为植物中一个重要的转录因子家族,在植物生长与非生物逆境胁迫过程中起重要作用,在抗病,盐胁迫等方向研究较多,但在果树中参与花青苷调控的分子机制仍不清楚,利用课题组选育的高类黄酮优异种质‘紫红一号’研究其参与花青苷合成的机理,为接下来我们的育种技术提供了理论支持。本研究以红肉苹果‘红脆一号’和‘紫红一号’的幼嫩叶片诱导的愈伤组织为试验材料,开展相关实验,主要结果如下:1.MdWRKY40序列的开放阅读框为966bp,能够编码321个氨基酸。统进化树分析表明MdWRKY40与拟南芥的AtWRKY18和AtWRKY40在同一进化分支上,通过氨基酸序列分析,我们发现MdWRKY40蛋白中含有一个亮氨酸拉链基序和WRKY结构域。2.在红肉苹果愈伤组织中过表达MdMYB111,愈伤组织由紫红变为暗黄色,表明其对花青苷合成有抑制作用,而过表达MdWRKY40几乎没有任何变化,但是在过表达MdMYB111和MdWRKY40后,我们发现颜色褪至暗黄的愈伤又逐渐变为粉红色,表明两者在某种机制下共同参与了花青苷的调控。3.酵母双杂交实验和双分子荧光互补实验表明MdWRKY40可以与自身相互作用形成同源二聚体,而MdMYB111与MdWRKY40并不发生相互作用;凝胶阻滞实验(EMSA)表明,MdMYB111可以与MdANS启动子上的MRE元件结合,进而抑制MdANS的表达,而MdWRKY40可以绑定到MdANS启动子的W-Box上,二者共同作用时可以减弱MdMYB111对MdANS的抑制作用。4.利用重叠PCR技术敲除MdWRKY40中的亮氨酸拉链基序得到的片段命名为LLSMdWRKY40,发现其不能再过自身相互作用形成同源二聚体,转红肉苹果愈伤组织后发现,在二者存在的情况下,并不能弱化MdMYB111对花青苷起的抑制作用;敲除C-X5-C序列得到的片段命名为LCSMdWRKY40,使其无法绑定MdANS启动子的W-Box,同样转红肉苹果愈伤组织后发现,在二者存在的情况下,也不能弱化MdMYB111对花青苷起的抑制作用。