【摘 要】
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小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是一种急性、热性、接触性传染病,其病原小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)主要感染山羊和绵羊。PPR所导致的高死亡率,给畜牧业造成了巨大的经济损失。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是低氧、病原微生物感染、钙失衡等非稳态条件下
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(NO:32072895);
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小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是一种急性、热性、接触性传染病,其病原小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)主要感染山羊和绵羊。PPR所导致的高死亡率,给畜牧业造成了巨大的经济损失。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是低氧、病原微生物感染、钙失衡等非稳态条件下引起的未折叠蛋白和错误折叠蛋白在细胞内质网腔内大量积累的一种生物现象。细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物的保护机制,病毒感染宿主细胞后,可以通过自噬降解病毒及其零件、衰老及受损细胞器等来维持细胞稳态。许多病毒入侵宿主细胞后通过诱导内质网应激来调控细胞自噬,从而影响病毒复制。本实验室前期研究发现,PPRV感染山羊子宫内膜上皮细胞(Caprine endometrial epithelial cells,EECs)后,诱导内质网应激和细胞自噬有利于病毒复制。但PPRV诱导的内质网应激与细胞自噬之间的关系及其关系对病毒复制的影响仍不清楚。围绕这个科学问题,展开了相关研究:1.PPRV诱导宿主细胞内质网应激对细胞自噬的影响。PPRV感染EECs后使用内质网应激抑制剂4-PBA处理,免疫印迹试验结果显示,4-PBA显著抑制内质网应激标志分子GRP78和细胞自噬标志分子LC3-II的蛋白表达量;激光共聚焦显微镜观察发现,4-PBA处理明显减少了PPRV感染的细胞中LC3点状信号聚集的数量。PPRV感染EECs后使用内质网应激激活剂TG处理,蛋白质免疫印迹结果显示,GRP78和LC3-II的表达量均被显著上调;激光共聚焦显微镜观察发现,TG处理明显增加PPRV诱导的LC3点状信号聚集的数量和荧光强度。结果表明,PPRV通过诱导宿主细胞内质网应激促进细胞自噬。2.PERK/eIF2α通路调控PPRV诱导的细胞自噬。PPRV感染EECs后使用GSK2606414(简称GSK)处理,以降低PERK/eIF2α通路激活程度,通过免疫印迹试验发现,GSK明显降低了PERK磷酸化的水平,并显著下调LC3-II和PPRV-N的蛋白表达量;结果表明,PPRV激活的PERK/eIF2α通路参与内质网应激对细胞自噬的调控,进而促进病毒复制。在EECs中转染不同的小干扰RNA(si RNA)分别抑制PERK、eIF2α和ATF4的表达,然后感染PPRV,通过免疫印迹试验发现,PERK、eIF2α、ATF4的蛋白表达水平均被显著下调,并导致自噬相关分子LC3-II、ATG5、ATG7、HSP70和PPRV-N的表达水平被显著抑制。试验结果表明,PERK、eIF2α、ATF4通过上调自噬相关分子ATG5、ATG7、HSP70、LC3-II的表达,以此实现PERK/eIF2α通路对细胞自噬的正向调控,最终利于PPRV复制。3.PPRV的N蛋白和C蛋白通过激活PERK/eIF2α通路调控细胞自噬。在EECs中分别转染带有PPRV的N和C基因的质粒,通过免疫印迹试验分析N蛋白和C蛋白对PERK/eIF2α通路和自噬的影响。结果发现,N蛋白和C蛋白促进内质网应激标志分子GRP78和PERK/eIF2α通路中的p-eIF2α、ATF4的表达,并显著上调了细胞自噬相关分子ATG5、ATG7、LC3-II的表达。结果表明,PPRV的N蛋白和C蛋白参与激活PERK/eIF2α通路,促进细胞自噬。用4-PBA分别抑制N蛋白和C蛋白诱导的内质网应激,发现4-PBA处理明显降低了LC3-II的表达。结果表明,N蛋白和C蛋白通过诱导内质网应激调控细胞自噬。使用GSK分别抑制N蛋白和C蛋白激活的PERK/eIF2α通路,发现ATG5、ATG7、LC3-II蛋白的表达量均被显著下调。以上结果表明,PPRV的N蛋白和C蛋白通过激活PERK/eIF2α通路来促进细胞自噬。综上所述,PPRV感染EECs后能诱导内质网应激促进细胞自噬。PPRV的N蛋白和C蛋白激活宿主细胞PERK/eIF2α通路上调细胞自噬和促进病毒复制。本研究加深了对PPRV致病机理的认识,为小反刍兽疫的防治提供理论依据。
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