研究背景:食管癌是常见的恶性肿瘤之一,全球发病率位列第8位,我国发病率列第5位。鳞癌和腺癌是食管癌常见的病理类型,其中我国90%以上为鳞癌。由于疾病早期症状不明显,多数患者诊断时即为中晚期,且多伴有营养不良,加之部分病变于手术切除难度大、药物治疗效果欠佳等因素,总体5年生存率较低。同步放化疗仍是不能手术或拒绝手术的局部晚期食管鳞癌患者的标准治疗手段,但对于高龄、严重心肺并发症或营养不良等无法耐受同步放化疗的食管癌患者,目前仍没有行之有效的靶向治疗药物?近十年来,靶向治疗以其低毒副作用、高治疗有效率将肿瘤治疗带入精准治疗时代。因此从食管癌发生、发展过程中寻找潜在的分子靶点指导临床治疗仍然十分必要。BEX(The Brain-expressed X-linked protein)蛋白家族是功能尚不明确的小分子蛋白信号中介体,目前发现BEX1、BEX2、BEX3、BEX4、BEX5等5个成员。最初研究显示BEX1主要表达于中枢神经系统中,参与胚胎期神经细胞分化、神经元损伤后修复再生等过程。随着研究的深入,发现BEX1在多种组织、器官及器官发育的不同阶段都有动态表达,并参与细胞周期调控、凋亡、神经元修复及肌肉组织再生等多种病理生理过程。近年来陆续有文献报道发现BEX1参与急慢性白血病、恶性胶质瘤、室管膜瘤及口腔鳞状细胞癌的发生、发展过程。多项甲基化芯片检测发现BEX1在胶质瘤、口腔鳞癌组织中存在广泛甲基化状态,且mRNA、蛋白表达水平普遍降低,后续实验均提示其抑癌作用。目前尚未见食管鳞癌肿瘤组织中BEX1表达情况及其临床意义的研究。本研究首先利用免疫组化检测BEX1在食管鳞癌肿瘤组织及正常食管黏膜中的表达情况,并分析其表达水平与食管鳞癌患者各临床病理因素及预后的相关性;然后构建过表达BEX1细胞,探讨BEX1对食管鳞癌常见细胞增殖、转移等常见恶性生物行为的影响,初步明确其生物学功能;最后探讨BEX1影响食管鳞癌生物学行为的潜在分子机制,为后续研究奠定基础。第一部分BEX1在食管鳞癌组织中的表达及其临床意义研究目的:本部分主要研究118例食管鳞癌肿瘤组织及对应正常食管黏膜组织中BEX1的蛋白表达情况,并统计分析BEX1表达水平与患者各临床病理因素及预后的相关性。研究方法:1.通过查询病案资料,搜集2009年1月1日至2010年12月31日期间于滨州医学院附属医院行根治性食管癌切除手术的患者共1 18例。所有患者手术前均未接受过放射治疗、化疗、靶向治疗等抗肿瘤治疗,术后病理为鳞状细胞癌。收集的临床病理因素包括:性别、年龄、吸烟史、饮酒史、肿瘤位置、病变长度、肿瘤细胞分化程度、T分期、N分期及术后分期(pTNM)情况。通过住院号、病理号检索上述118例患者肿瘤组织及切缘正常黏膜组织标本。2.利用免疫组化法检测食管鳞癌肿瘤及正常食管黏膜组织中BEX1的表达部位及水平有无差异。3.卡方检验分析BEX1表达水平与食管鳞癌患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤位置、病变长度、肿瘤细胞分化程度、T分期、N分期及术后分期等常见临床病理因素有无相关性。4.采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,Log-rank检验比较不同BEX1表达水平食管鳞癌患者预后有无差别。5.采用COX单因素与多因素风险模型分析BEX1表达水平及上述各临床病理因素与食管鳞癌术后患者预后相关性。研究结果:1.BEX1蛋白在肿瘤细胞及食管黏膜上皮细胞的胞浆表达,部分细胞核中亦有少量表达。在正常食管黏膜组织中,约92.37%(109/118)标本BEX1呈高表达,而在食管鳞癌肿瘤组织中,只有38.98%(46/118)的标本呈高表达,两者差异有统计学意义(P<0.001)。2.BEX1表达水平与病变长度(P<0.001)、T分期(P=0.011)及TNM分期(P=0.039)呈负相关性,与性别(P=0.688)、年龄(P=0.312)、吸烟史(P=0.266)、饮酒史(P=0.099)、病变位置(P=0.604)、组织分化程度(P=0.077)、淋巴结转移数目(P=0.1 78)等无明显相关性。3.Kaplan-Meier法绘制生存曲线,BEX1低表达组患者5年生存率为29.1 7%(21/72),而BEX1高表达组患者5年生存率为63.04%(29/46)。Log-rank检验显示食管鳞癌术后标本低表达BEX1患者预后更差,两组差异有统计学意义(P<0.001)。4.COX单因素分析显示病变长度(P=0.002)、T分期(P<0.001)、N分期(P<0.001)、pTNM分期(P<0.001)、BEX1表达情况(P<0.001)均与患者预后相关。而性别(P=0.286)、年龄(P=0.767)、吸烟史(P=0.155)、饮酒史(P=0.463)、分化程度(P=0.645)与患者预后无相关性。COX多因素分析结果显示T分期(P=0.034)、N分期(P=0.007)、pTNM分期(P=0.025)、BEX1表达情况(P=0.039)均与患者预后相关。结论:1.BEX1在食管鳞癌肿瘤组织中表达水平显著低于正常食管黏膜上皮,且BEX1表达水平与食管病变长度、T分期及术后分期呈负相关性。2.低表达BEX1的食管鳞癌患者术后5年总体生存率显著低于高表达BEX1患者。3.T分期、N分期、pTNM分期及BEX1低表达是食管鳞癌患者术后预后不良的独立影响因素。第二部分BEX1对食管鳞癌细胞恶性生物学行为的影响研究目的:1.本部分研究旨在检测常见食管鳞癌细胞系中BEX1 mRNA及蛋白表达情况。2.构建BEX1真核表达载体、慢病毒颗粒及对照颗粒。3.体外实验探讨过表达BEX1后对食管鳞癌TE-1、Eca-109细胞增殖、侵袭转移、凋亡等常见恶性生物学行为影响。4.构建裸鼠移植瘤模型观察过表达BEX1对食管鳞癌TE-1细胞体内增殖能力的影响。研究方法:1.首先应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、Western Blot法检测食管永生化上皮细胞SHEE及食管鳞癌TE-1、Eca-109和EC9706中BEX1 mRNA及蛋白表达水平。2.构建表达BEX1的真核表达载体pENTER-BEX1及LV5-BEX1的慢病毒颗粒。3.采用Real-time PCR、Western Blot法检测转染BEX 1后mRNA及蛋白表达水平是否显著升高。4.采用MTT法、平板克隆法、Transwell侵袭实验、流式细胞检测法观察TE-1,Eca-109诱导细胞前后增殖、侵袭转移、细胞周期分布等变化。5.裸鼠体内移植瘤模型法检测过表达BEX1对食管鳞癌TE-1细胞瘤体体积及重量的影响。研究结果:1.Real-time PCR显示:TE-1、Eca-109 和 EC9706中BEX1 mRNA均低于SHEE,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot显示食管鳞癌TE-1、Eca-109和EC9706细胞中BEX1蛋白表达水平均显著低于SHEE细胞(P<0.05)。2.实时荧光定量PCR及Western Blot显示TE-1、Eca-109细胞转染BEX1真核表达载体后,mRNA及蛋白水平较前明显增高(P<0.01)。3.MTT法显示TE-1细胞过表达BEX1后自36h至72h开始显著低于对照组,随着培养时间延长,差距逐渐增大(P<0.05)。Eca-109细胞过表达BEX1后48h至72h增殖能力显著降低(P<0.05)。4.TE-1细胞过表达BEX1后,克隆形成数目由56.67±5.51降低为33.00±2.65,差异有统计学差异(P=0.033)。同样Eca109过表达BEX1后克隆数目由111±8.19降低为51.00±4.00,差异有统计学意义(P=0.009)。5.Transwell侵袭实验显示:TE-1细胞转染BEX1后穿膜细胞数目为:137.20±31.88,对照组为:148.40±26.20,结果无统计学差异(P=0.561)。同样Eca109细胞转染BEX1后穿膜细胞数目为:98.20±18.67,对照组为:88.00±18.71,结果无统计学差异(P=0.413)。6.流式细胞周期分析显示:转染前TE-1细胞周期分布为:G0/G1、S、G2/M期比例为:(67.13±1.12)%、(24±0.87)%、(8.3±0.44)%,过表达 BEX1 后为:(65.33±1.05)%、(24.23±0.5 5)%、(8.57±0.67)%,结果无统计学意义(P>0.05)。转染前Eca109细胞周期分布为G0/G1、S、G2/M期比例为:(61.13±1.50)%、(27.7±0.61)%、(9.97±1.72)%,过表达 BEX1 后为:(65.83±2.61)%、(22.33±1.29)%、(8.87±0.23)%,结果无统计学意义(P>0.05)。7.TE-1细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型显示:第4、8、12、16、20、24天对照组、BEX1稳定过表达组移植瘤体积(mm3)分别为:82.752±69.782 VS 32.354±31.030(P>0.05)、232.208±167.200 VS 125.496±79.798(P>0.05)、385.574士200.547 VS 188.783±124.138(P<0.05)、622.366±307.795 VS 254.381±159.052(P<0.01)、946.030±597.060 VS 282.303±162.429(P<0.0 1)、1464.549±808.755VS 453.968±269.265(P<0.01)。8.对照组TE-1最终移植瘤重量为0.47±0.29g,过表达BEX1组最终移植瘤重量为1.57±0.55g,差异有显著统计学意义(P=0.013)。研究结论:1.食管鳞癌常见细胞系中BEX1 mRNA、蛋白表达水平均普遍降低。2.过表达BEX1显著抑制食管鳞癌TE-1、Eca-1 09细胞体外增殖、平板克隆形成能力,对侵袭、转移、细胞周期分布及凋亡无显著影响。3.BEX1过表达显著抑制食管鳞癌裸鼠移植瘤生长。第三部分BEX1抑制食管鳞癌细胞增殖的分子机制初步探索研究目的:结合文献既有报道,探讨BEX1调节食管鳞癌细胞增殖可能涉及的分子机制。研究方法:1.Western Blot法检测过表达BEX1前后TE-1、Eca-109细胞中PI3K/AKT通路中核心蛋白AKT、p-AKT蛋白表达变化。2.Western Blot法检测过表达BEX1前后TE-1、Eca-109细胞中NF-κB经典通路中P65、p-P65蛋白表达变化。3.NF-κB荧光素酶报告基因检测BEX 1对NF-κB信号通路转录活性影响。研究结果:1.转染BEX1前后食管鳞癌TE-1、Eca-109细胞中AKT、p-AKT蛋白表达无明显差异。2.转染BEX1前后食管鳞癌TE-1、Eca-109细胞中P65、p-P65蛋白表达降低。3.过表达BEX1显著抑制食管鳞癌TE-1细胞NF-κB转录活性。研究结论:过表达BEX 1可抑制食管鳞癌细胞中NF-κB经典通路中核心蛋白P65、p-P65蛋白表达水平并抑制NF-κB通路转录活性。NF-κB通路可能是BEX 1抑制食管鳞癌细胞增殖的分子机制。