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Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是动物天然免疫信号传递中最重要的模式识别受体（pathogen recognition receptor,PRR）之一。作为最古老的受体家族,TLRs在体腔动物中广泛存在,在无脊椎动物昆虫以Tolls命名,在脊椎动物以TLRs命名。Tolls和TLRs是导致昆虫和脊椎动物发生不同免疫响应信号传递的关键跨膜受体蛋白家族,其功能分化和分歧进化是目前国内外的关注热点。昆虫Tolls和脊椎动物TLRs识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern,PAMP）的方式不同。在昆虫中,病原物PAMPs首先激活丝氨酸/苏氨酸蛋白酶系统,通过细胞介素Sp?tzle才能激活Toll。而脊椎动物TLRs作为PRR可以直接识别特定的PAMPs。此外,脊椎动物TLRs只参与免疫,而昆虫Toll受体除了参与免疫还在胚胎发育过程中起重要作用。这说明昆虫Toll和脊椎动物TLRs之间存在差异。Imler对昆虫Toll和哺乳动物TLRs进行进化树分析,结果显示TLRs的进化呈现两个分支:来自黑腹果蝇和冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的Tolls形成一个分支;哺乳动物小鼠（Mus musculus）和人类（Homo sapiens）的TLRs同属第二个分支,唯一例外的是昆虫Toll9,昆虫Toll9与哺乳动物TLR4在同一个分支,暗示昆虫Toll9与脊椎动物TLR4在进化关系上相近。其次,我们对Bm Toll9和TLR4的分子结构分析发现二者结构也极为相似。那么昆虫Toll9是否与脊椎动物TLR4具有相同的功能及作用机制?TLR4在哺乳动物中是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）的中心受体,LPS是位于革兰氏阴性细菌最外层的细胞壁的常见组分。我们在前期研究中发现,用商品试剂高纯度的LPS诱导家蚕（Bombyx mori）,取血淋巴做抑菌实验,其抑菌活性增强;同时通过RT-q PCR检测发现Bm ML（哺乳动物MD2类似蛋白）超家族成员Bm Esr16及抗菌肽基因Moricin、Cecropin B等在脂肪体中的转录活性增强,这些结果暗示LPS可以引发家蚕的先天免疫途径。由上述文献依据和我们前期的实验结果,提示LPS诱导家蚕的先天免疫响应机制可能与Bm Toll9和Bm MLs蛋白有关。结合Toll9与哺乳动物TLR4的进化关系,我们猜测昆虫Toll9功能可能与脊椎动物TLR4相似,具有直接识别病原PAMPs引发家蚕激发先天免疫的功能。为了验证这一猜想,我们以家蚕Bm Toll9和Bm MLs蛋白为研究对象,选题“Bm MLs辅助Bm Toll9直接识别脂多糖LPS引发家蚕先天免疫的研究”,通过RT-q PCR、Western-blotting、免疫共沉淀、Bm Toll9超表达与小鼠TLR4构建嵌合受体Bm Toll9-TLR4等分子生物学方法,探讨Bm Toll9是否参与家蚕先天免疫以及Bm Toll9能否直接与病原物PAMPs识别。研究获得以下主要结果:（1）用LPS诱导家蚕,获得了脂质结合蛋白Bm Esr16（Bm MLs蛋白之一）。生物信息学分析发现,Bm Esr16结构与哺乳动物髓样分化蛋白-2（myeloid differentiationa-2,MD-2）类似,具有4个保守的半胱氨酸形成2个二硫键,并富含β-折叠结构。Bm Esr16能够结合LPS,用Bm Esr16抗体注射家蚕,封闭内源Bm Esr16蛋白活性后,家蚕抗菌肽转录表达受阻,表明Bm Esr16在LPS识别及免疫通路中发挥重要作用。（2）生物信息学分析发现Bm Toll9含有745个氨基酸,具有跨膜结构域,在其末端C-端侧翼有保守的scctlr基序,属于V型TLR。Bm Toll9在免疫器官中肠、脂肪体和血细胞都有表达。抗体封闭家蚕体内Bm Toll9活性后,家蚕血淋巴响应LPS诱导的抗菌活性会受到抑制。表明Bm Toll9参与了LPS诱导家蚕的先天免疫通路。（3）通过细胞水平的免疫共沉淀和免疫荧光共定位检测,发现Bm Toll9胞外域能够与Bm Esr16和Bm PP结合;通过活体水平的Westernblot检测,表明Bm Toll9、Bm Esr16和Bm PP在中肠、脂肪体和血细胞的时空表达一致,提示这三种蛋白在家蚕发育过程中有相互协调的作用;进而在Bm N和S2细胞中过表达Bm Toll9,同时分别添加Bm Esr16、Bm PP做辅助蛋白,抗菌肽基因Moricin,Cecropin B6和Lebocin3在LPS诱导下的转录表达上调。这三个实验证据表明Bm Esr16和Bm PP能够协助Bm Toll9形成二聚体响应LPS诱导的免疫反应,这与哺乳动物中MD2协助TLR4响应LPS诱导免疫反应类似。（4）构建Bm Toll9-TLR4嵌合受体并转染哺乳动物RAW264.7,抗体封闭RAW264.7细胞中TLR4本底活性后,嵌合受体Bm Toll9-Hs TIR4在辅助蛋白Bm Esr16、Bm PP的帮助下能够被LPS诱导从而促进细胞中免疫相关因子IL6和TNFα的分泌,同时上清中NO含量增高。结果表明,在LPS刺激下,Bm Toll9的功能与哺乳动物中TLR4相似,能直接识别PAMPs激发天然免疫。综上研究结果得出以下结论:Bm Toll9在Bm MLs辅助下直接识别脂多糖LPS引发家蚕先天免疫的研究,其识别方式与哺乳动物TLR4相似。这一结论暗示在家蚕中可能存在独立于经典的昆虫Toll通路的直接识别病原物PAMPs的分子信号机制。本文研究结果将加深目前对昆虫免疫分子调控机制的理解,丰富对昆虫Tolls和脊椎动物TLRs在免疫信号传递中发生功能分化和分歧进化的认识,为解释动物天然免疫的起源提供参考,也可为培育家蚕抗病品种提供参考。