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背景心脏移植(Heart transplantation)是改善终末期心力衰竭患者的生活质量和延长其生存时间的唯一手段。心脏移植手术病例数逐年增多,而每年需要接受心脏移植手术的患者数更是大幅度地上升。而目前在临床上,供体心脏的最长冷缺血保存时间仅为4-6小时,这大大限制了移植的比例。故探索如何减轻低温保存诱导的心肌损伤及延长心脏保存时间具有迫切的现实意义。组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)抑制剂被证明可在多种心血管疾病的发生发展中对抗心肌损伤。此外,研究发现非特异性HDAC抑制剂可通过减轻实验性心衰动物心肌氧化应激和炎症,改善心肌能量代谢,延缓心肌肥大和纤维化,从而增强心功能。故我们推测RGFP966可能具有减轻低温保存诱导的心肌损伤的作用。目的本实验的目的在于采用离体大鼠心脏低温保存模型,观察HDAC3抑制剂RGFP966是否能够促进低温保存心脏复灌期心功能的恢复,并探讨Hippo-YAP信号通路是否参与了RGFP966的心肌保护作用。方法1)建立心脏Langendorff灌流模型。将大鼠离体心脏的主动脉套入Langendorff灌流管,并用手术缝线固定。用改良的Krebs-Henseleit(KH)液从主动脉根部逆行恒压灌注。2)建立心脏低温保存模型:将大鼠离体心脏置于含有或不含有不同浓度的RGFP966的Celsior保存液中,4℃保存12h。随后将心脏重新固定在Langendorff灌流装置,进行复灌60min。3)心功能的测定:将心室内压检测用球囊通过左心耳插入左心室,球囊的一端连接压力换能器,采用Med Lab生物信号采集处理系统记录心功能各指标,如左心室舒张末期压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP),左心室发展压(left ventricular developed pressure,LVDP),最大左心室收缩压(maximal systolic velocity of left ventricular pressure,+d P/dtmax),最大左心室舒张压(maximal diastolic velocity of left ventricular pressure,-d P/dtmax),心率(Heart rate,HR)和冠状动脉流量。4)Western blotting分析:提取心肌组织总蛋白或核蛋白,检测心脏组织中HDAC3、p-Mst1、Mst1、p-YAP、YAP、Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax等蛋白的表达水平。5)RT-PCR实验:提取心肌组织的总RNA。按照Prime Script?RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒说明书操作,将RNA反转录为c DNA。利用7500fast荧光定量PCR仪,采用两步法PCR扩增标准程序进行扩增反应。6)冠脉流出液中LDH活性测定:收集心脏复灌注期的冠脉流出液。按照LDH测定(比色法)试剂盒的使用说明进行LDH活性测定。7)心肌MDA含量、SOD活性、CAT活性和GPx活性测定:取适量心室肌组织,按MDA检测试剂盒使用说明书操作,测定组织中MDA含量。按SOD活性检测试剂盒(WST-8法)使用说明书操作,测定组织中SOD活性。按CAT测定(钼酸铵法)试剂盒使用说明测定组织中CAT活性。按总谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)检测试剂盒使用说明测定组织中GPx活性。8)免疫组化法观察心肌形态:取左心室组织,石蜡包埋后切片。切片脱蜡后进行苏木精和曙红染色。9)TUNEL染色:取石蜡切片,脱蜡透膜后,加入TUNEL反应液孵育1h后,行DAB显色。显微镜下观察并计数TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)数。结果1)在Celsior液中添加了RGFP966(0.25-0.75μM)后,不仅可抑制低温保存引起的HDAC3蛋白高表达升高,还可浓度依赖性地改善低温保存心脏复灌期心功能的恢复,即抑制低温保存诱导的LVEDP升高,以及LVDP和±d P/dtmax的降低;并能促进心脏复苏后冠脉流量的恢复,降低冠脉流出液LDH活性和心肌MDA含量。2)低温保存后,心肌p-Mst1/Mst1和p-YAP/YAP比值升高,总YAP和核YAP的表达下降。RGFP966可逆转上述现象。3)用verteporfin抑制YAP-Tead相互作用后,可部分取消RGFP966对低温保存心脏心功能的保护作用。4)RGFP966可增加低温保存心肌抗氧化基因(SOD、GPx、CAT)和抗凋亡基因(Bcl-2)的m RNA表达下降,上调SOD、GPx、CAT酶活性和Bcl-2蛋白表达,降低Bax和cleaved Caspase-3的表达,减少凋亡的发生。上述作用同样可被verteporfin所阻断。结论RGFP966可以促进低温保存心脏复灌期心功能的恢复,其作用机制可能是通过抑制Hippo-YAP信号传导通路的激活,增强心肌抗氧化能力,抑制心肌细胞凋亡而实现的。