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转化生长因子-β激活激酶1(Transforming growth factor-βactivated kinase-1,TAK1)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员。研究表明,哺乳动物的TAK1及其结合蛋白TAB1(TAK1-binding protein 1)是NF-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路中关键的上游调节因子,二者互作可激活NF-κB启动子,触发下游的NF-κB级联反应,从而参与细胞分化、细胞凋亡和免疫调节等重要生理病理过程。尽管草鱼细胞中存在NF-κB信号通路,但Ci TAK1蛋白及其与Ci TAB1蛋白的互作是否具有激活Ci NF-κB启动子的作用尚不清楚。本实验室前期研究发现,拟态弧菌靶向核酸疫苗可显著增强草鱼肠黏膜免疫,免疫肠组织中Ci TAK1蛋白显著上调并富集于Ci NF-κB信号通路,推测Ci TAK1蛋白介导Ci NF-κB信号通路激活参与调控上述肠黏膜免疫增强作用。对此,本课题以Ci TAK1蛋白为研究对象,分析Ci TAK1基因在健康草鱼组织以及免疫刺激前后CIK细胞中的转录表达模式,确定Ci TAK1蛋白的亚细胞定位及其与Ci TAB1蛋白共定位情况。在此基础上,利用草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idellus kidney,CIK)细胞模型进一步探讨Ci TAK1蛋白过表达对Ci NF-κB启动子活性的影响,从而为深入研究Ci TAK1蛋白在Ci NF-κB信号通路的调节作用奠定基础。主要研究内容和结果总结如下:1)Ci TAK1基因的转录表达模式分析。论文中使用TRNzol-A~+总RNA提取试剂提取健康草鱼组织总RNA、反转录为c DNA,并以此为模板采用RT-q PCR方法检测Ci TAK1基因在9种不同组织中的转录表达谱,结果发现该基因在各检测组织中广泛转录表达。随后,分别以不同浓度的脂多糖、肿瘤坏死因子-α和拟态弧菌疫苗抗原刺激CIK细胞,检测免疫刺激前后Ci TAK1基因的时序转录水平。结果表明,Ci TAK1是一种免疫相关蛋白,三种免疫刺激剂均能诱导其转录水平显著上调,但时序转录表达水平依刺激物及其浓度的不同而异。2)Ci TAK1蛋白的亚细胞定位与共定位分析。论文中首先利用在线分析软件预测Ci TAK1蛋白的亚细胞定位。然后,构建三个带有荧光标签的真核表达重组质粒(pm Cherry-C1-Ci TAK1,p EGFP-C1-Ci TAK1和pm Cherry-C1-Ci TAB1)。最后,将上述重组质粒单转或共转CIK细胞,并对转染后细胞进行多聚甲醛固定和DAPI染核。结果在共聚焦显微镜(1200×)或荧光显微镜下(400×)下观察到单转重组质粒pm Cherry-C1-Ci TAK1的CIK细胞的胞质部位发出红色荧光,共转重组质粒p EGFP-Ci TAK1和pm Cherry-Ci TAB1的细胞中,绿色荧光(EGFP-Ci TAK1)与红色荧光(m Cherry-Ci TAB1)重叠,在胞质中形成橘黄色荧光,确定Ci TAK1蛋白是一种胞质蛋白,且与Ci TAB1蛋白在胞质内共定位。3)Ci TAK1基因过表达对Ci NF-κB启动子活性的影响。论文中首先构建报告基因载体(p GL3-basic-Ci NF-κB1)和过表达载体(p CMV-Myc-Ci TAK1,p CMV-Myc-Ci TAB1)。然后,采用Western blotting检测上述过表达载体在CIK细胞中的表达情况。最后,将上述报告基因载体以及过表达载体共转CIK细胞中,在有或无免疫刺激情况下,采用双萤光素酶报告基因试验分析Ci TAK1蛋白及其与Ci TAB1蛋白互作对Ci NF-κB1启动子的影响。Western blotting检测结果显示,无论单转还是共转,Ci TAK1与Ci TAB1蛋白均可在CIK细胞中良好表达。双萤光素酶报告基因试验结果显示,Ci TAK1蛋白过表达、Ci TAK1与Ci TAB1共同过表达均能显著激活Ci NF-κB1启动子活性,且后者激活水平高于前者,而Ci TAB1蛋白过表达可显著抑制启动子活性。同时发现,免疫刺激也能激活Ci NF-κB1启动子活性,尤其是在Ci TAK1与Ci TAB1共同过表达时可极显著提高Ci NF-κB1启动子活性,而Ci TAK1蛋白过表达对启动子活性无明显影响,Ci TAB1蛋白过表达对其仍呈现抑制作用。综上所述,Ci TAK1基因在草鱼组织中广泛转录表达,且免疫刺激剂能够显著上调其转录表达水平。Ci TAK1蛋白是一种胞质蛋白,且与Ci TAB1蛋白在胞质内存在共定位。过表达Ci TAK1、Ci TAK1与Ci TAB1共同过表达以及拟态弧菌疫苗抗原均能激活Ci NF-κB1启动子活性,且后二者具有协同激活作用。本研究结果为深入探究Ci TAK1蛋白在Ci NF-κB信号通路的调节作用奠定了良好基础。