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突触是神经元之间相互联系,传递各种生物电信号、化学信号的关键部位。NMDA受体(N-methyl-D-aspartate receptors,NMDA受体)是哺乳动物神经系统中重要的离子通道型谷氨酸受体。根据其在细胞膜表面的分布特点,可分为突触内及突触外NMDA受体。但是,由于选择性分离突触内及突触外NMDA受体在技术上存在一定难度,一直以来学者们无法对分布在细胞膜表面不同区域的NMDA受体群的功能进行研究。2002年Hardingham等人首次在培养的神经元上选择性地分离突触外NMDA受体,发现突触内NMDA受体与突触外NMDA受体对环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)基因表达调控,细胞内信号途径以及细胞的生长与死亡上具有相反的作用。钙离子经激活的突触内NMDA受体进入细胞内,可诱导CREB水平上调,脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophicfactor,BDNF)表达增加,促进神经细胞生长;反之,突触外NMDA受体激活后下调CREB水平,使得BDNF表达降低,导致细胞凋亡。但是,关于突触外NMDA受体在长时程增强(long-term potentiation,LTP)中的作用仍然未见有研究报道。在本研究中,我们从三个方面研究了成年小鼠海马切片的CA1区突触外NMDA受体在长时程增强中的作用:1应用膜片钳记录技术及场电位记录技术建立成年小鼠海马切片上选择性记录突触内、外NMDA受体介导的电流或者电压的方法;2阐明突触外NMDA受体对LTP形成的作用;3研究突触内、外不同NMDA受体亚单位对LTP诱导的作用。主要的方法及结果:1选择性记录突触内、外NMDA受体介导的膜片钳全细胞电流:(1)制作7～8周健康雄性C57BL/6J小鼠的急性海马切片(厚度400微米)。(2)选取海马CA1区,表面光滑、立体感强的锥体神经元进行红外线可视全细胞膜片钳记录,灌流非NMDA受体阻断剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)以及伽马氨基丁酸A(GABAA)受体阻断剂木防己苦毒素(picrotoxin),在电压钳模式下将锥体神经元钳制在+40 mV,针对CA1区Schaffer Collateral-Commissural纤维每隔15 sec给予一次电刺激,记录突触内NMDA受体介导的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic current,EPSC)。(3)灌流NMDA受体的非竞争性及不可逆性阻断剂MK-801(20μM),20分钟后给予5 Hz/16 sec的低频刺激,阻断突触内NMDA-EPSC。(4)洗脱MK-801,30分钟后给予短串高频刺激(100 Hz,100 msec),记录突触外NMDA受体介导的EPSC。2突触内、外NMDA受体在长时程可塑性中的作用:在场电位记录模式下记录海马切片CA1区兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential,EPSP),灌流MK-801二十分钟,然后给予5 Hz/16 sec刺激阻断突触内NMDA受体,洗脱MK-801, 30～50分钟后,给予3次高频强直刺激(100 Hz/1 sec, 15秒间隔)激活突触外NMDA受体,60分钟后检测LTP的形成,结果发现没有LTP形成。在场电位记录模式下,单纯给予5 Hz低频刺激激活突触内NMDA受体,没有诱导LTP形成。3不同NMDA受体亚单位的作用:利用NR2A或者NR2B亚单位的阻断剂研究不同NMDA受体亚单位对LTP形成的影响。阻断NR2B亚单位后,无论是选择性激活突触外NMDA受体还是选择性激活突触内NMDA受体,均可以诱导出LTP;而阻断NR2A亚单位后,不论是选择性激活突触外NMDA受体,还是选择性激活突触内NMDA受体,均不能诱导出LTP。主要结论:1)无论是在突触外还是在突触内,NR2B亚单位都负向调控LTP诱导;2) LTP的形成受到突触内、外NR2A及NR2B亚基之间的平衡调控。在本课题中,我们结合运用神经药理方法以及不同的电生理刺激模式,在成年小鼠海马急性切片上建立了选择性激活突触内及突触外NMDA受体的实验方法,为研究突触外NMDA受体的生理及病理功能提供了良好的神经生物学实验方法。运用该方法,我们首次阐明了突触外NMDA受体在LTP形成中的作用。