研究背景和目的:肾细胞癌是肾组织肿瘤中最常见的一种肿瘤,其中50%以上的肾癌患者死于肿瘤转移。因此,为了准确判断预后及对病人实行个体化治疗,进一步了解肿瘤转移的生物学机制及筛选肿瘤转移的相关生物标记物成了当务之急。近年来,越来越多的研究显示肿瘤微环境中的细胞因子,尤其是肿瘤坏死因子a会增强肾癌的运动能力,进而增加肾癌的转移。然而,其调节肿瘤细胞转移的机制尚不明确。Rictor是组成mTORC2的关键分子,其功能涉及到调节细胞骨架重构、细胞迁移、细胞存活和增殖等方面上。我们课题组之前的研究表明m TORC2中的Rictor在乳腺癌组织中高表达,并与患者淋巴结转移的出现密切相关,降低肿瘤细胞中Rictor的表达可以明显抑制肿瘤细胞的运动和转移。但是目前有关m TORC2/Rictor的功能研究还处于初步探讨阶段,尤其在肾癌运动转移方面的研究更为有限。本研究第一部分主要通过体内外实验探讨Rictor在肾癌转移的功能作用。本研究第二部分则运用细胞生物学和分子生物学实验方法,研究促炎因子TNFa处理对肾癌细胞运动能力的影响,以及Rictor在该过程中的功能及其分子机制,以明确Rictor在TNFa促进肿瘤细胞运动这一现象中的作用。希望本研究能深化人们对肿瘤转移分子机制的认识,力求能为临床提早发现和治疗肿瘤转移提供新的思路、观点和依据。研究方法:1)应用慢病毒包装系统感染人肾癌细胞系ACHN,利用Western Blotting和实时定量PCR技术检测Rictor降表达效率。2)利用划痕实验、趋化实验以及侵袭实验观察稳定降表达Rictor细胞的运动能力的变化。3)利用严重联合免疫缺陷小鼠建立肿瘤移植瘤转移模型,根据小鼠肝、肺组织HE染色结果研究下调Rictor的表达对肾癌细胞转移能力的影响,并通过计算原发瘤体积初步评估下调Rictor的表达对肾癌细胞增殖能力的影响。4)应用划痕实验、趋化实验和侵袭实验观察TNFa处理后ACHN细胞运动能力的改变,以及降表达Rictor对TNFa处理后ACHN细胞运动能力的影响。5)应用Western Blotting和实时定量技术检测TNFa处理后ACHN细胞内Rictor的表达情况。6)应用Western Blotting和免疫荧光技术分别检测TNFa处理后ACHN细胞内IkBa的含量和磷酸化的变化,以及p65细胞内转位的情况。7)应用萤光素酶报告基因检测系统和染色体免疫共沉淀技术分析RICTOR启动位点上游序列,以探究RICTOR的转录调控机制。结果:1)慢病毒感染后,ACHN细胞内Rictor表达量明显下调。2)稳定降表达Rictor的ACHN细胞相比空白组和对照组运动能力明显减弱。3)稳定降表达Rictor的ACHN细胞在小鼠肺和肝脏转移少于实验对照组,且稳定降表达Rictor的肾癌细胞相比对照组在小鼠体内的成瘤能力降低。4)TNFa处理能增强AHCN对照组细胞的迁移和EGF诱导下的趋化和侵袭能力,而降表达Rictor能够抑制TNFa处理对细胞运动的增强作用。5)Western Blotting和RT-PCR结果证实TNFa处理可以在m RNA和蛋白水平上增加ACHN细胞内Rictor表达。6)Western Blotting结果显示TNFa处理后,ACHN细胞中的IkBa表达量可见明显降低,而磷酸化的IkBa可见明显升高。免疫荧光结果则证实TNFa处理后,转录因子p65从胞浆转位至胞核。7)萤光素酶报告基因检测结果显示RICTOR转录起始位点上游-51bp至-301bp区域的缺失时,该序列的转录活性明显下降。染色体免疫共沉淀实验则进一步证实p65能富集在该区域。结论:1)体内外实验显示Rictor与肾癌细胞转移能力和增殖能力相关,降表达Rictor可以抑制肾癌细胞的运动转移能力和成瘤能力。??TNF?能够激活ACHN细胞中NF-?B通路,进而增加细胞内Rictor表达量,从而实现其增强肾癌细胞运动能力的作用,降表达Rictor能够抑制TNF?对细胞运动的促进作用。?