银杏酚酸单体分离及其生物活性研究

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水产动物病害是制约水产业发展的主要瓶颈之一,据统计资料显示,2005年,水产养殖因病害造成的直接经济损失达110.00亿元。药物防治是目前渔业生产中最主要的措施,而当前渔药主要是移植人药、兽药和部分农药等化学药物,长期使用带来的是环境污染、药物残留、耐药性等一系列问题,也成为我国水产品出口的绿色贸易堡垒问题。植物源渔药,具有低毒、低残留、对环境无污染等优点。所以,从植物中寻找新的杀菌、杀虫活性物质或药物前体,不仅是有效创制新药的经济、快捷途径,而且也是对植物资源的合理开发与利用,本研究是以此为出发点,首先从银杏外种皮提取物中分离出银杏酚酸,然后分离出银杏酚酸的各单体化合物,对其进行进行杀灭鱼类指环虫和抑制鱼类病原菌的活性测定,并对活性单体进行结构鉴定,为充分利用银杏外种皮这一天然资源,扩大其在水产养殖中的应用提供基础资料。本研究所取得的结果如下:1.银杏外种皮中银杏酚酸的分离及其含量测定。银杏外种皮干燥粉碎后,用乙醇进行回流提取,所得浸膏用石油醚萃取,然后对石油醚萃取物进行硅胶柱层析,以氯仿-甲醇(1:0、200:1、100:1、50:1、25:1、12.5:1、5:1、2:1、1:1)进行梯度洗脱,经TLC检测后,将主要含银杏酚酸的组分再次进行硅胶柱层析,以石油醚-乙酸乙酯(1:0、200:1、100:1、99:1、98:2、97:3、95:5、90:10、80:20、2:1)进行梯度洗脱,经TLC检测,合并得到银杏酚酸分离物。通过TLC、UV、HPLC、IR和LC-MS分析,确定分离物是银杏酚酸,纯度为86.7%;银杏酚酸混合物中C15:1、C17:1、C13:0、C15:0、C17:2五成分相对百分含量分别为49.85%、22.57%、20.08%、3.22%、2.89%。2.银杏酚酸单体的分离和生物活性测定。采用RP-HPLC分离技术分离银杏酚酸中的各单体成分,色谱柱为ODS-A C18 5μm 120Å,10mmx250mm;流动相为甲醇:4%HAc溶液(93.5:6.5,v/v);紫外检测波长310nm。分离获得G-1、G-2、G-3、G-4、G-5五种单体。各单体杀灭鱼类指环虫结果表明:单体G-1)浓度在1.0~2.0 mg.L-1时,杀虫率可达90~100%;单体G-2浓度在5.0~7.0 mg.L-1时杀虫率可达90~100%;G-3、G-4、G-5三种单体杀虫活性较低,对鱼的毒性相对较高。各单体抑制鱼类病原菌的结果表明:五种单体化合物,对鳗弧菌、点状产气单胞菌点状亚种、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、哈维弧菌、杀鲑气单胞菌和水霉的MIC、MBC均大于100μg.mL-1;对柱状黄杆菌G-1MIC为6.25μg.mL-1、MBC为7.40μg.mL-1;G-2的MIC为11.25μg.mL-1、MBC为12.5μg.mL-1;G-3的MIC为25μg.mL-1、MBC为32μg.mL-1; G-4、的MIC、MBC均为50μg.mL-1;G-5的MIC、MBC均大于100μg.mL-1。G-1和G-2是银杏酚酸中杀灭鱼类指环虫和抑制病原菌的主要活性物质。3.银杏酚酸活性单体波谱分析。通过TLC、IR、EIMS,1 NMR、13NMR等分析和结构解析,化合物G-1、G-2分别鉴定为6-(十三碳烷基)-水杨酸(C13:0)、和6-(8`Z-十五碳烯)-水杨酸(C15:1)。4.银杏酚酸对鲫鱼的急性毒性试验结果表明,第24h的LC5 0为3.8468 mg.L-1,第48h的LC5 0为3.7288 mg.L-1;银杏酚酸48h对鲫鱼的安全浓度为1.0511 mg.L-1
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