背景急性腹泻在婴幼儿中具有很高的发病率（morbidity）和死亡率（mortality）,尤其是在发展中国家,每年有超过200万的儿童死于急性腹泻。据报道世界范围内每年有超过7亿五岁以下的儿童发生急性腹泻。随着手消毒技术的应用和环境卫生的改善,细菌和寄生虫导致的腹泻逐渐减少。但因缺乏有效的治疗措施,病毒相关腹泻的控制并不是十分理想。诺如病毒（Norovirus, NoV）、轮状病毒（Rotavirus, RV）、腺病毒（Adenovirus, ADV）、札如病毒（Sapovirus, SLV）和星状病毒（Astro virus, ASV）都是病毒性腹泻常见的病原体。急性腹泻已经成为仅次于肺炎的儿童死亡的第二大原因,成为儿童的公共健康问题。目的掌握中国重庆地区儿童急性腹泻感染病毒性病原体构成谱及其流行特征,探讨重点病原体——诺如病毒主要的流行毒株基因型、流行趋势、及其基因变异进化特征,并了解重庆地区是否存在新的诺如病毒重组株；了解腹泻儿童感染博卡病毒的型别及其流行特征。方法2009年8月到2013年11月,以重庆医科大学附属儿童医院为哨点医院,开展急性腹泻病毒的实验室检测,按照统一标准纳入重庆医科大学附属儿童医院门诊部的急性腹泻患者,通过标准的腹泻问卷调查与门诊信息收集,获取病人的人口学信息和临床症状。收集患者急性期的粪便标本,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、Real-Time PCR和常规PCR等方法检测8种常见腹泻病毒：A组轮状病毒（Group A Rotavirus, RVA）、B组轮状病毒（Group B Rotavirus, RVB）、C组轮状病毒（Group C Rotavirus, RVC）、诺如病毒Ⅰ型（Norovirus type Ⅰ, GⅠ）,诺如病毒Ⅱ型（Norovirus type Ⅱ, GⅡ）、ADV、ASV和SLV。对诺如病毒检测阳性的标本进一步获取ORF1和ORF2的目的基因片段序列。对基因序列进行同源性分析和重组分析,将诺如病毒的基因序列上传到www.Noronet.nl、利用自动诺如病毒分型工具分别对ORF1和ORF2进行基因分型,ORF1基因型与ORF2基因型不一致时提示重组株的存在。分别对诺如病毒的多聚酶区和衣壳蛋白区的核酸序列做进化树,并与Noronet分型结果进行对比,进一步确定重组株的存在。对新的重组基因型分别利用RDP4和SimPlot进行重组分析,确定重组位点。PCR扩增博卡病毒,产物测序后在NCBI进行序列比对,确定博卡病毒的基因型,并从GenBank下载国内外HBoV的标准株序列,使用Mega5.1建立进化树。结果1.急性腹泻病毒的病原谱及其流行特征（1）研究期间共纳入门诊急性腹泻患者2416例,腹泻病毒的检出率为70.58%。其中诺如病毒检出率最高,为50.82%,其他依次为轮状病38.82%,腺病毒4.63%,星状病毒3.76%和札如病毒2.64%。其中586例患者发生复合感染,诺如病毒和轮状病毒复合感染是最常见的复合感染类型。（2）诺如病毒检测阳性率在7-12月的儿童最高（56.64%）,与小于6个月的儿童（44.21%）和大于2岁的儿童（45.62%）相比具有显著性差异（卡方检验,P<0.0001）。7-24个月之间儿童轮状病毒的检出率,以及发生复合感染的概率高于小于6个月和大于2岁的儿童（轮状病毒,P<0.0001；复合感染：卡方检验,P<0.0001）。不同性别的腹泻儿童的病毒阳性检出率无统计学差异（P=0.4095）。（3）GⅡ型诺如病毒和A组轮状病毒的感染流行均具有明显的季节性。GⅡ型诺如病毒的阳性检出率在夏秋季（7-11月）为高峰,春季（3-5月）为低谷。RVA检测阳性率呈现双峰分布,在秋季和冬季出现两个流行高峰,在夏季的检出率最低。2012年春季GⅡ型诺如病毒的检出率存在异常的高峰,提示可能存在GII型诺如病毒的暴发。（4）GⅡ患者就诊前腹泻天数长于RVA患者（3.61VS3.23,P=0.0118）,但是两者就诊前的平均腹泻次数无统计学差异（5.89VS6.01,P=0.5031）; RVA感染患者发生呕吐的概率高于GⅡ（56.69VS50.00, P=0.0220）。复合感染患者发生呕吐的比例高于单一病毒感染（57.17%VS50.08%,P=0.0064）。2.诺如病毒的基因型分布及重组状况（1）不同年份流行的诺如病毒基因型存在较大的差异。2010年重庆地区的流行型别为GⅡ.42006b和GⅡ4New Orleans2009;2011年的流行株为GⅡ.12/GⅡ.3和GⅡ.42006b；2012年9月份前,GⅡ.42006b是主要的流行株,10月份首次在重庆检测到GⅡ.4Sydney₂012,并迅速取代2006b成为重庆地区中最要的流行株；2013年GⅡ.4Sydney₂012和GⅡ.12/GⅡ.3成为最重要的流行株,GⅡ.42006b不再流行。几种主要流行株GⅡ.42006b、GⅡ.12/GⅡ.3、GⅡ.4Sydney₂012的感染患者的年龄和性别构成以及临床症状均无统计学差异。（2）重庆地区检测到的散发诺如病毒基因型包括GⅡ.16/GⅡ.2、GⅡ.21/GⅡ.3、 GⅡ.15/GⅡ.15、GⅡ.6/GⅡ.6和GⅡ16/GⅡ.13。其中GⅡ.16/GⅡ.13重组株为首次在中国地区检测到。SimPlot重组分析和RDP.4重组分析都证实GⅡ.16/GⅡ.13重组株的存在。重庆GⅡ.16/GⅡ.13与2012年引起德国Berlin、Luckenwalde和Oranienburg等城市大规模的急性胃肠炎暴发的Berlin1195/2012/DE（KC832472）同源性高达99%,但其在重庆地区只引起少量的散发病例。3.博卡病毒的基因型分布及重组状况（1）2011年共收集腹泻标本504份,共有49份样本为HBoV阳性,检出阳性率为9.72%。男性儿童阳性31例,检出率为10.20%；女性儿童18例,检出率为9.00%。不同性别的患儿之间HBoV的检出率无统计学差异（P=0.759）。不同年龄段之间的HBoV的检出率无统计学差异（P=0.280）。HBoV分布具有季节性,在2月份和7-8月份存在两个检出率的高峰（P=0.002）。（2）根据BLAST比对和NSl核酸序列进化树的结果,将检测到的HBoV分为3型,25株（51.02%）为HBoV1,23（46.94%）株为HBoV2,1株（2.04）为HBoV3,其检出率分别为4.96%,4.56%和0.20%。重庆地区腹泻样本中HBoV病毒NS1序列的同源性为79.9～100%,HBoV1组内的同源性为98.8～100%,HBoV2组内的同源性为99.3～100%。重庆地区腹泻HBov1与呼吸道的HBoVl有很高的同源性（98-100%）。HBoV2主要为HBoV-2B型,与FJ375129/Shanghai和FJ973559/Nigeria在进化树上有很高的同源性,与EU082213/USA同源性较远。腹泻样本1031病毒株与HBoV3病毒株JN086998/USA的同源性高达100%。结论：1.急性腹泻病毒的病原谱及其流行特征门诊儿童急性腹泻患者大多由病毒引起,其中GII型诺如病毒和A组轮状病毒是引起门诊儿童腹泻的主要病原体,其他依次为ADV、ASV和SLV。7-24个月为GⅡ和RVA告高发年龄段儿童。GⅡ和RVA的感染流行均具有明显的季节性,但两种病毒的主要流行季节并不相同。GⅡ的病毒阳性检出率在夏秋季为高峰。而RVA在秋季和冬季出现两个流行高峰。门诊儿童患者GⅡ的住院前就诊天数长于RVA, RVA并发呕吐概率高于GⅡ。复合感染患者发生呕吐的比例显著高于单一病毒感染患者。2.诺如病毒的基因型分布及重组状况（1）不同年份流行的诺如病毒基因型不同。到2013年GⅡ.12/GⅡ.3和GⅡ.4Sydney₂012已经取代GⅡ.42006b和GⅡ.4New Orleans2009成为重要的流行株。研究发现重庆的诺如病毒流行基因型的与时间密切相关,而且非常具有典型性。一方面,世界范围的的流行株GⅡ.42006b和GⅡ.4New Orleans2009在重庆地区的流行与消失,以及最新的世界范围的流行株GⅡ.4Sydney₂012在重庆的出现并流行的时间与世界其他地方基本吻合。另一方面,具有地域性的,主要在亚太地区流行的GⅡ.12/GⅡ.3于2012-2013年在重庆地区也有很高的检出率。（2）重庆地区检测到的散发诺如病毒基因型包括GⅡ.12/GⅡ.3GⅡ.15/GⅡ.15、GⅡ.6/GⅡ.6和GⅡ.16/GⅡ.13。其中GⅡ.16/GⅡ.13重组株为首次在中国地区检测到。SimPlot重组分析和RPD.4分析结果都证实重组株的存在。（3）2013年GⅡ.42006b消失后,我们在重庆检测到的流行病毒株和散发病毒株都为不同ORF1/ORF2基因型的重组株。重庆地区诺如病毒的流行模式作为一个实例说明了诺如病毒重组,特别是ORF1/ORF2重叠区的重组对于诺如病毒进化的重要意义。3.博卡病毒的基因型分布及重组状况对重庆地区急性腹泻儿童进行的HBoV监测结果显示重庆地区儿童中HBoV在不同性别和年龄段人群分布无统计学差异,但是HBoV分布具有明显的季节性,检出率在2月和7-8月存在两个高峰。HBoV1和HBoV2是HBoV主要的流行基因型,其中HBoV2全部为HBoV-2B。研究结果可为我国西南地区的儿童急性病毒性腹泻的防控提供本底数据和科学依据。