目的:　　创伤后应激障碍（Posttraumatic stress disorder，PTSD）又称延迟性创伤后应激障碍心因性反应(delayed psychogenic reaction)，是由于应激性事件或是处境引起的延迟性精神障碍，患者常常是因为突发性、威胁性灾难事件（如地震、海啸、洪灾等），面临极度惊恐场景，出现惊恐、忧伤、悲痛，导致个体延迟出现并长期持续存在的精神障碍，患者往往伴有侵入性创伤性事件的记忆为特征，并伴有情绪的易激惹和回避行为，其诊断最早见于1980年出版的美国精神障碍诊断与统计手册第三版(DSM-Ⅲ)[1，2]。简而言之:PTSD是一种创伤后心理失平衡状态，患者有明显的心理和生理症状，其病程长、难以治愈、并且严重影响患者的日常生活和社会稳定[3]。近20年来，随着突发性灾难事件逐渐增多，以及恐怖爆炸、自杀事件包括战争、严重事故等的频发，几乎所有经历这类事件的人都会感到巨大的痛苦，常引起个体极度恐惧、害怕、无助感，因此PTSD受到越来越多学者的关注。关于PTSD发病机制的探讨现主要涉及神经生物学、神经心理学、神经精神病学等多个学科领域。　　记忆紊乱是PTSD的症状之一，并且也是其临床诊断标准之一[4]，对大量经历过战争、政治暴力、大屠杀[5，6]或儿童期有被虐待史的PTSD患者的研究表明，明显的记忆障碍[7-11]是其共有的症状，而这些记忆问题又成为PTSD继续发展的危险因素之一。现有的研究均支持，记忆障碍与神经生物学[12]的异常，以及中枢神经系统结构和机能异常[13]密切相关。其一，闯入性记忆（intrusive memory）是PTSD患者记忆损害主要的临床表现，表现为不由自主地回想创伤场景，提取事件信息、场景，导致患者警觉水平持续性升高，这也是PTSD核心症状之一[14]。其二，陈述性记忆的普遍性损害，通过记忆检测方法对患者进行记忆能力检测，发现视觉性记忆和言语陈述性记忆均与不同程度的受损，但言语陈述性记忆障碍要明显[15]。其三是创伤性遗忘，又称为空白性记忆(impoverished memory)，表现为创伤过程、信息的难以表达、模糊的记忆，甚至是完全无意识。　　大量研究证实，PTSD患者存在下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic—pituitary-adrenal axis，HPA)功能的紊乱，PTSD患者存在持续低水平皮质醇反应，同时伴有一定程度的海马、杏仁核、前额皮质(medial prefrontal cortex，mPFC)等的功能、影像学及形态学改变。本课题组前期研究也发现PTSD大鼠mPFC有糖皮质激素受体的高表达[16]，盐皮质激素受体表达变化[17]。前额叶调节着杏仁核对恐惧刺激的过度反应，PTSD所致的前额叶功能减低，使得对杏仁核调节和控制作用减弱，导致杏仁核对恐惧刺激过度反应，这可能也是PTSD患者恐惧反应长时间无法消退的原因;而海马、mPFC和杏仁核环路之间联系的失调以及海马区的损伤则参与了PTSD患者言语陈述性记忆障碍的损伤表现。所有这些均提示着mPFC是PTSD的关键脑区。　　细胞凋亡（apoptosis），又称程序性细胞死亡，是细胞循自身程序结束生命的主动性死亡过程。细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，是细胞有目的性、有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础[18]，是更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡发生过程的启动和进行均受到精确调控，具有独特而复杂的信号系统，与组织器官发育、机体正常生理功能及疾病的发生、发展密切相关。目前已知凋亡过程中伴随着一系列凋亡相关基因的表达，如Bcl-2家族、Caspase家族、Apaf-1基因、抑癌基因P53等。目前研究认为导致mPFC结构改变、体积缩小，引起功能下降的分子生物学机制可能与细胞凋亡有关。一般认为，细胞凋亡存在三条主要通路:线粒体通路、内质网通路和死亡受体信号通路，各通路间互相联系，共同调节细胞凋亡，而且也有研究发现PTSD大鼠mPFC神经元bcl-2/bax比值表达变化[19]。　　内质网凋亡途径是继线粒体通路、死亡受体信号通路之后，近些年发现的以内质网应激反应而引发细胞凋亡的通路，同样也是细胞凋亡的一条重要径路。内质网(endoplasmic reticulum，ER)是真核细胞蛋白质合成和Ca2+储存的场所，是细胞加工蛋白质的主要场所，负责分泌性蛋白的折叠、组装和分泌，其对内外环境的变化极为敏感。当细胞受到各种内外源刺激时，细胞内质网生理功能发生紊乱，导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。内质网介导的细胞凋亡至少包括两种机制，未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse UPR)和钙离子起始信号。内质网上钙通道改变，影响内质网功能，破坏蛋白质的合成、翻译和折叠，引发内质网应激。Caspase家族在机体调控凋亡和炎症反应方面可发挥一定作用，Caspase-12则是内质网应激的特异性介质，与不涉及内质网的凋亡通路无关[20]，Caspase-12表达的增加，仅在内质网应激发生时出现。　　内质网驻留蛋白-分子伴侣葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein94，GRP94)是一种高度保守的内质网驻留蛋白，属热休克蛋白家族成员，家族成员还有GRP78、GRP170、ERP72、PDI和GRP58。GRP94正常情况下即少量表达，其分布和表达均受细胞周期的调控。在正常细胞中GRP94具有协助新合成蛋白，促进内质网中未折叠蛋白正确折叠、修饰，抑制错误折叠蛋白分泌的作用。　　“单一连续刺激”(single prolonged stress，SPS)后内质网应激发生，内质网功能的紊乱，紧随其后的UPR，使其蛋白质组装和分泌受影响，细胞内堆积了大量未折叠和错误折叠的蛋白。内质网应激早期信号通过内质网膜传入细胞核和胞浆，效应蛋白上调GRP78和GRP94蛋白翻译，利于内质网腔内蛋白折叠、减少未折叠和错误折叠蛋白沉积和聚集，使细胞能够耐受和生存。过度的内质网应激使GRP94大量消耗，最终将导致细胞凋亡。　　实验方法:　　1、采用SPS方法建立PTSD大鼠模型，随机分为6组，即正常对照组、SPS刺激后1d、4d、7d、14d和28d组。　　2、Morris水迷宫检测系统检测PTSD大鼠学习记忆能力的改变。　　3、造模后，大鼠恐惧记忆的行为测定（僵立行为测定），大鼠负性心理行为测定（大鼠强迫游泳实验）。　　4、应用透射电镜技术、原位缺口末端标记法检测PTSD大鼠mPFC神经元凋亡变化。　　5、mPFC细胞内Ca2+离子浓度检测;细胞内游离Ca2+浓度检测:取正常对照组及SPS1d、4d、7d大鼠，经0.4％戊巴比妥麻醉，开颅取双侧mPFC100mg，常规方法制备106-107ml的细胞悬液，加入1mmol/L Fura-2/AM置于37℃避光孵育40min，荧光分光光度计检测。　　6、应用免疫组织化学技术检测GRP94、Capase-12的表达。　　7、Western Blotting方法检测GRP94、Capase-12蛋白表达。　　8、RT-PCR法检测GRP94 mRNA的表达。　　结果:　　一、PTSD大鼠生长一般情况观察　　SPS刺激后，大鼠出现精神萎靡，倦卧少动，皮毛稀松干涩无光泽，食欲减退，体重下降等，大鼠还出现易激惹、厮打行为多、大便稀溏等现象。　　二、PTSD大鼠Morris水迷宫记忆检测　　定向巡航实验用于测试大鼠学习记忆能力的改变，空间探索实验用于检测大鼠空间记忆能力的改变。定向巡航实验中，对照组和SPS组大鼠上台潜伏期均值，从第1天至第6天逐渐减低，第1天至第6天大鼠上台平均潜伏期均数，SPS组高于对照组，在统计学上有意义（P＜0.05），至第6天平均逃避潜伏期分别为（14.29±7.07）s和（45.47±6.83）s;空间探索实验中大鼠在靶向限花费的时间和穿越站台次数均不相同，SPS组靶向限穿越次数13.50±3.01，低于对照组的25.47±6.83(P＜0.05)。　　三、大鼠负性心理行为测定（大鼠强迫游泳实验）　　观察大鼠静止不动时间，静止不动行为指大鼠漂浮于水面，仅有为防止没入水中而进行的运动。对照组和SPS组大鼠强迫游泳实验期间，不动时间累计分别为（145.4±22.1）s和（165.8±19.5）s，PTSD-SPS大鼠负性心理行为高于对照组。　　四、恐惧记忆行为的测定（僵立行为测定）　　SPS组大鼠再次放入造模用的玻璃缸内（重新面临恐惧情景时），大鼠表现:行为活动明显减少，表现为刻板的蹲伏行为，仅头部有轻微的转动，背部拱起。同时大鼠还表现出全身情绪唤起的其他表现（如，大鼠全身毛发竖立）。对照组行为模式与SPS组明显不同。表现为自由运动，探究、理毛等行为。分析结果显示，两组间僵立百分比差异有统计学意义(P＜0.05)。　　五、PTSD大鼠mPFC神经元凋亡的检测　　1、透射电镜观察神经元凋亡　　SPS刺激后，mPFC部分神经元出现细胞凋亡改变。透射电镜观察可见核染色质固缩并凝结成块，形成新月状团块，沿核膜排列，进而细胞核固缩，核膜内陷，可见部分核裂解，凋亡小体可见。　　2、TUNEL染色结果　　PTSD大鼠mPFC部位TUNEL阳性细胞数明显多于正常对照组，且凋亡细胞数随着时间延长而逐渐增多，于SPS刺激后7d达高峰，后逐渐减少。　　六、mPFC细胞内Ca2+离子浓度变化　　与正常对照组相较，在SPS刺激后1d显著增高;至SPS刺激后7d，mPFC细胞内Ca2+离子浓度与SPS刺激后1d相比较降低幅度明显，已接近正常水平。　　七、PTSD大鼠mPFC中内质网凋亡相关因子Caspase-12的表达变化　　1、免疫组织化学结果　　免疫组织化学染色后大鼠mPFC可见Caspase-12阳性细胞，阳性信号为棕黄色颗粒，位于胞核和胞质，阳性产物在正常大鼠mPFC神经元内呈弱阳性反应，SPS后1d，Caspase-12表达开始逐渐增高，至SPS后7d达到高峰;后下降，至SPS后14d Caspase-12阳性细胞数已基本恢复至正常(P＞0.05)。　　2、Western blotting检测结果　　与正常对照组相比，SPS刺激后，Caspase-12蛋白出现表达，SPS刺激后1d表达明显增加，7d时表达最多，随后逐渐下降，至SPS后28d仍高于正常。　　八、PTSD大鼠mPFC中葡萄糖调节蛋白GRP94的表达变化　　1、免疫组织化学结果　　GRP94阳性细胞镜像呈现出棕黄色，GRP94在正常大鼠mPFC神经元内呈弱阳性反应，染色较浅。SPS刺激后，GRP94在SPS刺激后1d表达逐渐增强，7d达到高峰，随后开始降低，至SPS后28d仍高于正常。　　2、Westem Blotting分析结果　　与正常对照组相比，模型组GRP94蛋白水平均明显上调，PTSD早期，GRP94蛋白表达明显增强，于SPS刺激后7d达到高峰，此时显色最深;后表达下降，至28d仍高于正常对照组。　　3、RT-PCR检测结果　　正常大鼠mPFC神经元中GRP94 mRNA弱表达，SPS刺激后表达均明显增高。GRP94 mRNA于SPS刺激后7d达到高峰，14d开始下降。　　结论:　　1、PTSD-SPS大鼠，mPFC神经元出现凋亡变化，大鼠在学习记忆等方面出现明显的行为学异常，这可能是导致mPFC结构改变、体积减小，从而引起功能下降的原因之一，与PTSD的发病机制有一定关系。　　2、PTSD大鼠神经元内质网凋亡相关因子Caspase-12的表达变化与mPFC神经元内质网细胞凋亡相关。　　3、PTSD大鼠mPFC神经元GRP94表达变化，SPS刺激引发内质网应激，激活未折叠蛋白反应，这可能是导致PTSD大鼠mPFC神经元发生凋亡的另一重要机制。