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研究背景循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)是指由肿瘤原发灶释放进入外周循环系统中的肿瘤细胞,在癌症转移中具有关键作用。研究表明,相对于外周血未检测到CTCs的患者来说,检测到CTCs的患者预后较差;相对于治疗后CTCs数升高的患者来说,治疗后CTCs数降低的患者预后明显改善。因此,CTCs检测在肿瘤患者的鉴别诊断、生存期预测、治疗效果监测等方面有一定的应用价值。然而,由于CTCs数量稀少,其检测存在着重重困难。目前,基于CTCs的性质(如位于细胞表面的EpCAM)开发了一系列分离、检测技术,但都存在敏感性或者特异性不高等缺陷。因此探索能够从外周血细胞中准确、灵敏地检测出CTCs的技术是十分有必要的。凋亡素(Apoptin)是一种源自于鸡贫血病毒(CAV)的能够特异性促进肿瘤细胞凋亡的小分子蛋白。研究发现Apoptin在肿瘤细胞和正常细胞中的定位不同,它在肿瘤细胞主要定位在细胞核,而在正常细胞中主要定位在细胞质。Apoptin的这一特性为鉴别肿瘤细胞和正常细胞提供了理论基础,提示利用Apoptin的定位特点可以从外周血细胞中鉴定出CTCs。荧光素是一种能够产生荧光的有机合成染料,在激发光照射下可以释放出荧光,它能与蛋白质分子稳定结合,标记后不影响蛋白质的活性,荧光效率高且与蛋白结合的需要量小,性质稳定且易于保存,在科研实验中可用于同蛋白质结合以实现蛋白质的可视性。绿色荧光蛋白(GFP)是一种27kDa大小的蛋白质,该蛋白在激发光照射下,会发出绿色荧光。在生物学研究中常用GFP来作为生物标记。将这种荧光分子通过分子生物学手段结合在待标记的物质上,就可以在荧光显微镜下观察到被标记的物质。目的利用Apoptin在肿瘤细胞中的定位特点和荧光物质/绿色荧光蛋白的可视性,将蛋白质形式的Apoptin用荧光物质标记后作用于细胞,或者将Apoptin DNA序列与绿色荧光蛋白DNA序列融合后直接在细胞内表达,根据Apoptin在正常细胞和肿瘤细胞中的定位差异,来鉴别正常细胞和肿瘤细胞。方法1.构建原核表达质粒pET-28b(+)-TAT-Apoptin并表达重组蛋白。2.构建真核表达质粒pEGFP-N1-Apoptin、pcDNA3.1(+)-Apoptin。3.采用重叠延伸技术扩增Apoptin-1T基因(Thr-108突变为Gly)和Apoptin-3T基因(Thr-106、107、108突变为Gly、Pro、Gly),构建真核质粒pEGFP-N1-Apoptin-1T、pEGFP-N1-Apoptin-3T。4.利用lipo2000将真核表达质粒转染肿瘤细胞Saos-2、H460,在48h后用CCK8检测细胞活性,筛选出促肿瘤细胞凋亡作用最小的真核表达质粒。5.利用电转法将真核表达质粒转染正常细胞和肿瘤细胞,在转染后24h、48h、72h用Hoechst33342进行核染色,用荧光显微镜观察绿色荧光在细胞内分布情况,统计绿色、蓝色荧光同时聚集在细胞核的细胞数/同时有绿色、蓝色荧光的细胞数的百分比,该百分比分别代表Apoptin识别正常细胞的特异性和肿瘤细胞的敏感性,比较不同时间点时的敏感性,筛选出Apoptin识别肿瘤细胞能力最佳时的条件。6.收集临床肿瘤病人、体检正常人的外周血标本,用pEGFP-N1-Apoptin-3T转染PBMC,48h后用Hoechst33342进行核染色,用荧光显微镜观察绿色、蓝色荧光在细胞内的分布,并根据绿色、蓝色荧光的重叠情况,判断PBMC中的CTCs。结果1.成功构建了pET-28b(+)-TAT-Apoptin原核表达质粒,并表达出15kDa大小的蛋白,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化了Apoptin蛋白,但蛋白稳定性差,易沉淀,不适合用荧光素标记。2.成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-Apoptin、pcDNA3.1(+)-Apoptin、pEGFP-N1-Apoptin-1T、pEGFP-N1-Apoptin-3T。3.相比野生型Apoptin-EGFP,Apoptin-EGFP-3T对肿瘤细胞促凋亡作用下降,提示相较于野生型Apoptin-EGFP,Apoptin-EGFP-3T对CTCs的促凋亡作用下降。4.Apoptin-EGFP在正常细胞MSC中全部存在于细胞质,在肿瘤细胞Saos-2、H460中绝大部分聚集在细胞核,统计发现野生型Apoptin-EGFP、Apoptin-EGFP-1T、Apoptin-EGFP-3T在48h时识别肿瘤细胞的敏感性最高,且三种Apoptin-EGFP识别肿瘤细胞的敏感性无统计学差异。5.Apoptin-EGFP-3T在肺癌病人和正常人中识别CTCs的比率存在统计学差异(P<0.05),肺癌病人的CTCs比率明显高于正常人。结论1.基于pET-28b(+)质粒的原核表达系统能够表达TAT-Apoptin,但由于Apoptin蛋白稳定性差,在缓冲液中易形成沉淀,因此采用蛋白质标记形式不适合后续CTCs检测试验。2.在鉴别正常细胞MSC时,Apoptin-EGFP的特异性可达到100%。在鉴别肿瘤细胞Saos-2、H460时,Apoptin-EGFP的敏感性可分别达到49.53%±3.55%和40.82%±4.26%,最佳的检测时间点是转染后48h。3.本研究利用Apoptin-EGFP-3T转染并直接观察的方法在肺癌病人中检测出的CTCs比率明显高于正常人(P<0.05),说明该方法在CTCs检测中具有一定的潜在应用价值。