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该论文研究一株双歧杆菌的α-半乳糖苷酶及其基因,以及基因的高效表达,为建立双歧杆菌α-半乳糖苷酶转糖基作用体系,研究该酶转糖基作用的区域选择性,建立双歧杆菌α-半乳糖苷酶转糖基合成的α-D-半乳糖基寡糖单位库,酶法进行糖缀合物的加工奠定基础.首先进行了大肠杆菌中His-tag标记表达Bifidobacterium breve 203 α-D-半乳糖苷酶基因(aga1)的研究.根据该室已得B.breve 203α-半乳糖苷酶基因序列,设计引物,采用PCR技术,以B.breve 203染色体DNA为模板扩增得到酶基因片段(2.1Kb).将扩增产物连接至His-tag C-端标记表达载体pET22b的BamHI和EcoRI位点,命名为pET22b-aga1.将重组质粒pET22b-aga1转化E.coliBL21(DE3),经过IPTG诱导后,通过镍亲和层析柱进行分离提纯,最终得到了电泳纯酶蛋白,在垂直板SDS-PAGE中为一条带,显示了酶蛋白单个亚基分子量约为67KDa,纯酶在Native gradient PAGE和活性染色中未能显示出均一的带型.重组酶的N-端氨基酸序列为NH<,2>-T-K-R-L-L-E-I-T-S-V,根据N-端氨基酸序列以及之前的基因测序,从而最终确定了该α-半乳糖苷酶基因的ORF的真正起始位置是在BLAST预测的ORF的第三个ATG处.对该酶的蛋白质序列进行BLAST比对结果显示克隆并表达的α-半乳糖苷酶(Aga1)是以前所没有报道过的,属于一种新的酶蛋白,它与其他来源碱性α-半乳糖苷酶有一定的同源性,但在双歧杆菌中的发现属首次.该酶在Native-梯度电泳下不能形成均一的带型,可能是其在我们研究双歧杆菌的α-半乳糖苷酶过程中一直未能发现与纯化的原因,也有可能该蛋白在双歧杆菌中属于不可溶膜蛋白,在细胞破壁后提取可溶性α-半乳糖苷酶(Aga2)时很难得到,还有一个原因是该酶的表达目前采用了His-tag标记,可能也影响到其多聚体的性质.其次,进行了大肠杆菌中B.breve 203α-半乳糖苷酶(aga1)的温度诱导高效表达研究.利用PCR技术,将α-半乳糖苷酶基因(aga1)克隆连接至温度高效表达质粒pBV220的EcoRI和BamHI位点,命名为pBV-aga1.将重组质粒pBV-aga1分别转化E.coli DH5α、BL21、DH10B中,α-半乳糖苷酶基因(aga1)在这三株宿主菌中均可进行非融合性表达,比活分别为28.08units/mg、13.85units/mg、19.44units/mg,均高于B.breve 203(1.76units/mg).重组质粒pBV-aga1在E.coli BL21中稳定性较好,在无选择压力下,连续培养48h,可保持在80﹪,而在DH5α、DH10B中的稳定性较差.该重组酶经过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析、GigapiteK-100S柱层析和Amicon ultra PL-10浓缩并除盐,酶蛋白在垂直板SDS-PAGE中为一条带,证明已得到重组的α-半乳糖苷酶(Aga1)电泳纯,亚基分子量大小仍为67KDa,该酶在Native gradientPAGE和活性染色中仍未能显示出均一的带型.纯酶的比活为96.97units/mg,纯化倍数为7倍,得率为1.3﹪.通过DNASIS分析得到酶的等电点pI为5.19.最适反应温度为45℃,在40℃以下稳定,70℃时失去所有的酶活性;最适反应pH为4.0~4.4,在pH 3.6~6.0范围内稳定.Hg<+>、Cu<2+>、Ag<+>强烈抑制酶的活性,而Co<2+>、Mg<2+>、Ca<2+>、Mn<2+>、Zn<2+>、EDTA和DTT对酶活性没有抑制.最后,进行了短双歧杆菌B.breve 203中α-半乳糖苷酶基因aga2克隆的初步研究.为了克隆B.breve 203中的α-半乳糖苷酶基因(aga2),利用GenBank中检索到不同菌株的α-半乳糖苷酶基因的DNA序列,分析同源性从而设计简并引物对α-半乳糖苷酶基因保守区进行克隆,得到大小约500bp的保守区DNA片段,进行序列的测序与比对.