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动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种主要累及大中型动脉的慢性炎症疾病,在AS病变过程中,斑块不稳定性增加是导致急性心脑血管事件发生的首要危险因素,炎症反应是导致斑块不稳定性增加的中心环节。AS形成早期血液中单核细胞穿过损伤的内皮细胞（endothelial cells,ECs）进入血管壁并转化为巨噬细胞（macrophages,Mφ）,Mφ过量摄取氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）导致泡沫细胞的产生,加剧AS病理过程。同时,Mφ分泌多种促炎性因子诱导其他相关免疫细胞参与AS过程,而被募集的免疫细胞又可发挥促炎或抗炎效应,其发挥功能的主要途径包括:一方面通过细胞间彼此的相互作用,另一方面借助其分泌不同的细胞因子,影响AS的发展趋势。调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）以叉头框转录子P3（forkhead box P3,Fox-p3）为特异性标志,隶属于适应性免疫T细胞中负调节作用的免疫细胞,可通过上述免疫细胞间直接接触或通过功能性细胞因子IL-10或TGF-β抑制炎症反应,延缓AS病变的发展。本研究团队前期的实验发现四妙勇安汤及其活性成分异甘草素具有显著的PPAR-γ激动剂样作用,能够抑制多种炎症因子的活性。2012年Nature上发表的一项研究发现,激活的PPAR-γ能够促进Tregs募集,抑制免疫炎症,防治AS。因此,本研究从免疫炎症角度探讨四妙勇安汤激活PPAR-γ调节相关目的蛋白,募集Tregs增加,稳定AS斑块的作用机制。为丰富AS的发病机制研究提供新的视角,为深入研究四妙勇安汤抗AS的作用机制提供新思路。目的:本研究采用2周高脂喂养+右侧颈动脉套管术（Perivascular Carotid Collar Placement,PCCP）+8周高脂饲养制备ApoE-/-小鼠颈AS斑块模型,从炎症反应过程中的免疫调节角度,探讨四妙勇安汤及其活性成分异甘草素通过激活PPAR-γ及相关蛋白,募集Tregs,促进分泌抗炎细胞因子,发挥抑制炎症反应,进而稳定AS斑块的作用机制。方法:1实验一:ApoE-/-小鼠AS斑块模型制备采用ApoE-/-小鼠,应用PCCP术联合高脂制备AS颈动脉斑块模型,实验分假手术组、模型组。两组小鼠适应性喂养3天,改为高脂饲料继续喂养2周后,对模型组行PCCP手术造模,假手术组只分离血管不套管结扎,术后继续高脂饲养8周取材。采用全自动生化仪检测血清血脂四项:总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）;ELISA法检测血清氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）和超敏C反应蛋白（hs-CRP）含量;HE染色观察右侧颈总动脉斑块形成情况,测定并计算内膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）、血管管腔面积（LA）、斑块面积（PA）、内/中膜比值（IT/MT）、颈动脉狭窄率（PA/LA）。油红O染色和Masson染色分别观察颈右动脉脂质分布、胶原蛋白含量;采用免疫组化法评价MOMA-2和α-SMA在斑块处单核-Mφ和平滑肌肌动蛋白表达水平,并计算斑块的阳性表达率。综合以上指标评价PCCP联合高脂构建ApoE-/-小鼠AS颈动脉斑块模型。2实验二:四妙勇安汤对ApoE-/-小鼠AS颈动脉斑块保护作用的药效学及作用机制研究采用ApoE-/-小鼠,应用PCCP术联合高脂制备AS颈动脉斑块模型。本实验共分为5组:模型组、四妙勇安汤组、吡格列酮组、阿托伐他汀组。另设假手术组只分离血管不结扎为对照组,每组8只。PCCP术后开始给药,按四妙勇安汤:34.9g·kg-1、盐酸吡格列酮:2.28g·kg-1、阿托伐他汀:2.57g·kg-1的剂量每天灌胃给药1次;假手术组和模型组给予相同剂量去离子水,均连续灌胃8周。采用全自动生化仪检测血清中TC、TG、HDL、LDL的含量;ELISA法检测血清ox-LDL和hs-CRP含量;HE染色观察颈AS斑块病理形态,Masson染色观察颈动脉AS斑块胶原含量;免疫组织化学和蛋白质免疫印迹（Western blot）检测各组AS小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ,PPAR-γ）、肝X受体α（liver X receptor,LXR-α）、葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4,GLUT-4）、脂肪酸结合蛋白4（Fatty acid binding protein 4,FABP-4）、叉头框转录因子P3（forkhead Box P3,Fox-p3）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）、白介素 10（interleukin-10,IL-10）、基质金属蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2,MMP-2）、基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase9,MMP-9）的蛋白表达水平。3实验三:四妙勇安汤活性成分异甘草素对ApoE-/-小鼠AS颈动脉斑块保护的药理机制研究采用ApoE-/-小鼠,应用PCCP术联合高脂制备AS颈动脉斑块模型,分为模型组、异甘草素组,设立以普通饲料喂养的C57小鼠作为正常对照组,每组8只。异甘草素组给药剂量为2.16 g.kg-1,正常组和模型组给予等剂量去离子水,均灌胃给药/水8周。运用全自动生化仪检测血清中TC、TG、HDL、LDL含量;ELISA法检测ox-LDL和hs-CRP含量;HE染色观察AS颈动脉斑块病理形态,Western blot检测各组AS小鼠PPAR-γ、LXR-α、GLUT-4、FABP-4、Fox-p3、IL-10、TGF-β、MMP-2、MMP-9 的蛋白水平表达。结果:1实验一（1）血清血脂四项及ox-LDL检测结果显示:与假手术组比较,模型组TC、TG、LDL差异无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组比较,模型组ox-LDL水平明显增加（P＜0.01）。（2）炎症因子检测结果显示:与假手术比较,模型组小鼠血清hs-CRP显著升高（P＜0.01）。（3）颈动脉病理染色结果显示:假手术组小鼠颈动脉内皮细胞（ECs）排列稍不整齐,内膜不光滑,未见AS斑块形成。与假手术组比较,模型组小鼠颈动脉处可见大量泡沫细胞聚集在内皮下间隙,IT、PA、IT/MT、PA/LA均显著增加（P＜0.01）。油红O染色结果显示:与假手术组比较,模型组AS斑块处表现为大量红色脂滴,其脂质表达水平增加（P＜0.05）。Masson染色结果显示:与假手术组比较,模型组AS斑块处胶原含量增加（P＜0.05）,表现为蓝色胶原纤维多红色肌纤维较少。免疫组化MOMA-2和α-SMA染色结果显示:与假手术组比较,模型组MOMA-2阳性表达增加（P＜0.05）,α-SMA阳性表达较少（P＜0.05）。与假手术组比较,模型组AS颈动脉斑块易损指数增加（P＜0.01）,处于粥样斑块期。综合以上指标可判断该造模方法制备的AS颈动脉斑块成功。2实验二（1）血脂检测结果显示:与假手术组比较,模型组小鼠血清HDL升高明显（P＜0.01）,TC、TG、LDL水平表达无统计学意义（P＞0.05）;与模型组比较,四妙勇安汤组和阿托伐他汀组TC、LDL升高（P＜0.05,P＜0.01）,HDL显著降低（P＜0.01）,TG水平表达无统计学意义（P＞0.05）;吡格列酮组LDL显著升高（P＜0.01）,HDL显著降低（P＜0.01）,TC和TG无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组比,模型组小鼠血清ox-LDL表达明显增加（P＜0.01）;与模型组比较,四妙勇安汤组、吡格列酮组和阿托伐他汀组ox-LDL均显著降低（P＜0.01）。（2）炎症因子检测结果显示:与假手术组比,模型组小鼠血清hs-CRP显著升高（P＜0.01）;与模型组比较,四妙勇安汤组、吡格列酮组和阿托伐他汀组hs-CRP均显著降低（P＜0.01）。（3）颈动脉组织病理学观察显示:假手术组小鼠颈总动脉血管壁厚薄大体均一、结构完整,仅可见ECs略微排列不整齐,但未见AS斑块。与假手术组相比,模型组可见颈动脉内膜下泡沫细胞大量沉积,IT显著增加（P＜0.01）,PA增加（P＜0.05）,IT/MT显著增加（P＜0.01）,PA/LA明显增加（P＜0.01）,斑块明显形成。与模型组比较,四妙勇安汤组、吡格列酮组和阿托伐他汀组IT显著降低（P＜0.01）,IT/MT明显减少（P＜0.01）,PA/LA显著降低（P＜0.01）,PA减少。Masson染色结果显示:与假手术组比较,模型组颈动脉蓝色胶原纤维较多,但红色肌纤维表达甚少。与模型组比较,四妙勇安汤组、吡格列酮组、阿托伐他汀组红色的肌纤维表达较多而蓝色胶原纤维含量较少。（4）免疫组化结果显示:与假手术组比较,模型组PPAR-γ及其相关蛋白LXR-α、GLUT-4蛋白阳性表达较少,FABP-4阳性表达较多;Tregs特异性标志分子Fox-p3及其功能细胞分子TGF-β、IL-10阳性表达较少;AS斑块不稳定相关蛋白MMP-2、MMP-9阳性棕褐色颗粒面积较多。与模型组比较,四妙勇安汤组、吡格列酮组及阿托伐他汀组PPAR-y及其相关蛋白LXR-α、GLUT-4阳性表达均增多、FABP-4蛋白表达均减少;Tregs特异性标志分子Fox-p3及其功能细胞分子TGF-β、IL-10阳性表达均增多;AS斑块不稳定相关蛋白MMP-2、MMP-9阳性表达均减少。（5）Western blot结果显示:与假手术组比较,模型组PPAR-γ及其相关蛋白LXR-α、GLUT-4蛋白含量明显减少（P＜0.01）,FABP-4蛋白含量显著增加（P＜0.01）;Tregs特异性标志分子Fox-p3及其功能细胞分子IL-10、TGF-β表达量均减少（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01）;AS斑块不稳定相关蛋白MMP-2、MMP-9含量均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较,四妙勇安汤组PPAR-γ及其相关蛋白LXR-α、GLUT-4均增加（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05）,FABP-4蛋白表达减少（P＜0.05）;Tregs特异性标志分子Fox-p3及其功能细胞分子IL-10、TGF-β阳性表达均增加（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01）;AS斑块不稳定相关MMP-2、MMP-9的蛋白表达减少（P＜0.05,P＜0.01）。吡格列酮组PPAR-γ及其相关蛋白LXR-α、GLUT-4均增加（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05）,FABP-4蛋白表达减少（P＜0.05）;Tregs特异性标志分子Fox-p3及其功能细胞分子IL-10、TGF-β阳性表达均增加（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05）;AS斑块不稳定相关MMP-2、MMP-9的蛋白表达减少（P＜0.05,P＜0.01）。阿托伐他汀组PPAR-γ及其相关蛋白LXR-α、GLUT-4均增加（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05）,FABP-4蛋白表达减少（P＜0.05）;Tregs特异性标志分子Fox-p3及其功能细胞分子IL-10、TGF-β阳性表达均增加（P＜0.05）;AS斑块不稳定相关MMP-2、MMP-9的蛋白表达减少（P＜0.05,P＜0.01）。3实验三（1）血脂四项和ox-LDL检测结果显示:与正常组比较,模型组小鼠TC和LDL增加明显（P＜0.01）,HDL减少（P＜0.05）,TG差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较,异甘草素组HDL显著降低（P＜0.01）,LDL显著升高（P＜0.01）,TC和TG没有统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较,模型组小鼠血清ox-LDL显著升高（P＜0.01）;与模型组比较,异甘草素组小鼠ox-LDL明显降低（P＜0.01）。（2）炎症因子检测结果显示:与正常组比较,模型组小鼠血清hs-CRP显著升高（P＜0.01）;与模型组比较,异甘草素组小鼠hs-CRP降低明显（P＜0.01）。（3）颈动脉HE染色结果显示:正常组的血管壁结构完好,ECs和VSMCs均排列整齐、无增厚,ECs无泡沫细胞沉积,没有斑块产生。相比正常组,模型组可见管腔中央有巨形斑块阻塞,IT、PA、IT/MT、PA/LA均显著增加（P＜0.01）。与模型组比较,给予异甘草素治疗可见小鼠的IT、PA、PA/LA和IT/MT都显著降低（P＜0.01）。（4）Western blot结果显示:与正常组比较,模型组PPAR-γ及其相关蛋白LXR-α和GLUT-4蛋白表达水平明显减少（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05）,而FABP-4表达显著增加（P＜0.01）;Tregs特异性标志分子Fox-p3及其功能细胞分子IL-10、TGF-β阳性表达均减少（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01）;AS斑块不稳定相关蛋白MMP-2、MMP-9含量升高（P＜0.01,P＜0.05）。与模型组比较,异甘草素组小鼠PPAR-γ及其相关蛋白LXR-α和GLUT-4蛋白表达水平增加（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05）,FABP-4蛋白表达水平明显减少（P＜0.01）;Tregs特异性标志分子Fox-p3及其功能细胞分子IL-10、TGF-β阳性表达均增加（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01）;AS斑块不稳定关键蛋白MMP-2、MMP-9含量减少（P＜0.05）。结论:1 采用PCCP联合高脂制备AS颈动脉斑块模型,能够有效缩短AS模型制备周期,且PCCP处斑块局部严重程度明显加重,AS颈动脉斑块明显形成,处于AS粥样斑块期。2四妙勇安汤能够拮抗ox-LDL减少脂质在血管壁的沉着及泡沫细胞的产生,激活PPAR-γ,增加PPAR-γ相关LXR-α、GLUT-4蛋白表达,抑制FABP-4表达,同时募集Fox-p3+Tregs,增加抗炎细胞因子TGF-β、IL-10的表达,减少炎症因子hs-CRP的含量,从而抑制免疫炎症,减少AS斑块不稳定相关蛋白MMP-2、MMP-9的水平,从而抑制免疫炎症,增加AS斑块稳定性,减缓AS病理进程。3 四妙勇安汤活性成分异甘草素能够拮抗ox-LDL,减少脂质在血管壁的沉着及泡沫细胞的产生,激活PPAR-γ,增加PPAR-γ相关LXR-α、GLUT-4蛋白表达,抑制FABP-4表达,同时募集Fox-p3+Tregs,增加抗炎细胞因子TGF-β、IL-10的表达,减少炎症因子hs-CRP的含量,从而抑制免疫炎症,减少AS斑块不稳定相关蛋白MMP-2、MMP-9的水平,从而抑制免疫炎症,增加AS斑块稳定性,减缓AS病理进程。