大肠杆菌血红素合成途径关键酶基因的表达与调控

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血红素(heme)是一种重要的铁卟啉化合物,参与生物体内包括铁运输、抗氧化、信号调控以及多数血红素蛋白形成等生物功能。本论文以大肠杆菌(Escherichia coli)作为研究对象,以探究血红素合成途径中关键酶基因表达对终产物合成的调控为目标,通过转录组学对重组菌血红素合成的机理进行分析,并通过促进血红素合成的基因与芥蓝抗坏血酸过氧化物酶基因(apx)的共表达,增加内源血红素含量提高了过氧化物酶的活力。主要研究结果如下:(1)关键酶基因的过表达与环境因素对大肠杆菌血红素合成的调控。通过构建含有gltX、hemA、hemB、hemD、hemH和hemAD基因的同源重组大肠杆菌Eco/pEX、Eco/pEA、Eco/pEB、Eco/pED、Eco/pEH和Eco/pEAD,发现hemA基因对血红素卟啉的合成有明显的促进作用,Eco/pEA血红素产量可达26.53μmmol·-1,比对照组提升了8.08倍。而其他基因的过表达及hemA和hemD的共表达无明显效果。通过温度、溶氧及外源添加物对卟啉合成前体5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)及终产物血红素产量影响的分析,发现Fe2+、Glu或Glc均能提升5-ALA和血红素的含量,但温度及溶氧对5-ALA和血红素的影响存在差异。在37℃、200 mL装液量条件下添加0.2mmol·L-1 Glc,Eco/pEA的血红素产量最高,可达34.45μmol·L-1,比对照提高了10.79倍。(2)重组菌血红素合成机理分析。Eco/pEA在诱导表达后极易形成包涵体,虽然不同诱导条件下血红素产量存在差异,但是不同诱导条件均对血红素产量有明显的提升作用,通过RNA-seq分析可知:hemA的转录上调会影响菌体中血红素的积累,能大幅度提高它的产量,但是hemA转录程度过大时会引起hemD、hemF和arcA的转录下调对血红素积累不利,因此造成在不同诱导条件下Eco/pEA的血红素产量差异。同时hemA的转录大幅上调时会使糖酵解、丙酮酸代谢、脂肪酸降解和谷胱甘肽代谢受到抑制,但碳代谢与TCA循环中调控Gly,succinyl-CoA的酶基因如gcvP、gcvT、sucA、sucB、sucC和sucD等均上调,说明Gly和succinly-CoA在血红素合成过程中可能起着重要作用。另外,通过qRT-PCR分析可知hemB过表达会引起hemA、hemH的转录上调,hemD的转录下调;hemH的过表达会引起hemA、hemB的转录上调,hemD的转录下调,hemB和hemH会抑制血红素合成。在诱导条件下,Eco/pEB和Eco/pEH的谷氨酸脱氢酶基因gdhA和谷氨酸代谢酶基因asnA均呈上调趋势,gdhA和asnA的上调可能引起血红素含量的降低。(3)血红素表达调控在过氧化物酶异源表达中的应用。构建hemA和apx共表达菌株Eco/pEA-28A,结果发现,hemA过表达提高了E.coli胞内血红素的含量,APX比酶活由原来的58.23 U·g-1提升到495.20 U·g-1,成功实现了通过调控内源血红素含量的手段提高异源表达的过氧化物酶活力。
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