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研究背景与目的:乳酸杆菌是人体内重要的益生菌,具有抑制致病菌生长、调节免疫功能等作用。乳酸杆菌分泌物RNA是乳酸杆菌培养物中分离出的RNA成分,过去的研究表明其有一定抗肿瘤作用和免疫调节功能,但作用机制不清。Toll样受体是识别微生物相关分子模型的受体,在机体对微生物的免疫应答过程中发挥作用,其中TLR3识别双股RNA,免疫调节剂聚肌胞能激活TLR3诱导干扰素产生;TLR9能够识别CpG,CpG-ODN能激活TLR9,具有诱导干扰素产生等作用。本研究检测乳酸杆菌分泌物RNA免疫对小鼠肝癌H22的预防作用,并与干扰素、聚肌胞和榄香烯复合瘤苗进行比较,在此基础上从免疫学角度探讨其对巨噬细胞和树突状细胞免疫功能的调节作用。方法:1.给正常小鼠左腋皮下注射乳酸杆菌分泌物RNA或与榄香烯复合瘤苗联合,腹腔注射聚肌胞共七天,于第八天在小鼠右腋下接种H22细胞0.5×106/只,观察肿瘤体积和存活时间。2.于小鼠腹腔注射2ml 3%硫乙醇酸盐培养基,三天后收集腹腔巨噬细胞,并用乳酸杆菌分泌物RNA,CpG-ODN,LPS体外刺激腹腔巨噬细胞,用MTT法测定其对L929的杀伤作用。3.用IL-3、GM-CSF诱导小鼠脾细胞体外获取脾细胞来源的DC。乳酸杆菌分泌物RNA、聚肌胞及CpG-ODN单独或联合榄香烯复合瘤苗在体外分别刺激小鼠树突状细胞48小时,收集DC及培养上清,用MTT法测不同处理的DC对L929及H22细胞的杀伤活性,用ELISA法测DC培养上清中IFN-β的浓度。4.用免疫荧光法测定不同处理组脾细胞中CD8的表达。结果:1.不同处理对小鼠体内抑瘤作用的变化:○1平均生存时间:不同处理组的平均生存时间均大于对照组。其中瘤苗组与对照组之间差异显著(P<0.05)。○2肿瘤体积的动态变化:第20天和第22天各实验组肿瘤体积明显小于对照组,其中干扰素组及瘤苗组与对照组之间差异显著(P<0.05)。第24天,各组肿瘤体积明显小于对照组,对照组肿瘤体积增大明显,其中乳酸杆菌分泌物RNA组及瘤苗组与对照组之间差异显著(P<0.05)。第26天,各组肿瘤体积均小于对照组,其中乳酸杆菌分泌物RNA组、乳酸杆菌分泌物RNA+瘤苗组、瘤苗组及聚肌胞组与对照组之间差异显著(P<0.05)。第28天,各组肿瘤体积明显小于对照组,对照组肿瘤体积增大明显,其中乳酸杆菌分泌物RNA组、瘤苗组及聚肌胞组与对照组差异显著(P<0.05)。2.不同处理的小鼠腹腔巨噬细胞对L929的杀伤作用的影响:○1不同处理对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响:各组与对照组相比,均抑制小鼠腹腔巨噬细胞的增殖,其中乳酸杆菌分泌物RNA组与对照组之间差异显著(P<0.05)。○2不同处理的小鼠腹腔巨噬细胞培养上清对L929杀伤作用的影响(分泌型TNF-α活性):不同处理组与对照组相比,杀伤效率略有增高,但差异不显著。○3不同处理的小鼠腹腔巨噬细胞对L929杀伤作用的影响(膜结合型TNF-α活性):按效靶比50:1,LPS组与对照组相比,杀伤效率明显提高,差异显著(P<0.05)。3.脾脏来源的DC对小鼠L929细胞的杀伤作用:按效靶比10:1,各组与对照组相比,杀伤效率均有所提高,差异显著(P<0.05),其中以乳酸杆菌分泌物RNA+瘤苗溶解物组及CpG-ODN+瘤苗溶解物组杀伤效率增高明显。4.脾脏来源的DC对小鼠H22细胞的杀伤作用:按效靶比10:1,除瘤苗溶解物组外,其余各组与对照组相比,杀伤作用有所提高,差异显著(P<0.05),其中以CpG-ODN+瘤苗溶解物组杀伤效率最高。5.不同抗原冲激的脾脏来源DC培养上清中IFN-β的浓度:乳酸杆菌分泌物RNA组为203.57±31.68 pg/ml,乳酸杆菌分泌物RNA+瘤苗溶解物组为514.29±28.19pg/ml,瘤苗溶解物组为214.29±48.09pg/ml,CpG-ODN组为285.72±27.18 pg/ml,CpG-ODN+瘤苗溶解物组为328.57±42.06 pg/ml,聚肌胞(15μg/ml)组为128.57±26.08 pg/ml,聚肌胞(30μg/ml)组为228.57±25.51 pg/ml,单纯对照组为71.43±11.66 pg/ml。结果表明不同处理组与对照相比可促进DC分泌IFN-β,除聚肌胞(15μg/ml)组外,其余各处理组与对照组之间差异显著(P﹤0.05)。6.免疫荧光法测定不同处理组脾细胞中CD8的表达:免疫荧光结果显示:乳酸杆菌分泌物RNA组及乳酸杆菌分泌物RNA+瘤苗免疫组与对照组相比,无明显差异,胞浆荧光染色较暗。瘤苗免疫组胞浆荧光染色较对照组相比,明显较亮,胞浆中CD8表达量较高。结论:本实验结果表明乳酸杆菌分泌物RNA可延长荷瘤小鼠的生存时间以及减小其肿瘤体积。冲激脾脏来源的DC可以增强其杀伤L929、H22的作用、促进IFN-β的分泌。