作为一种有效治疗髋关节晚期疾病的手术手段,人工全髋关节置换能有效缓解髋部疼痛等症状,并明显改善髋关节功能。人工全髋关节置换术的手术程序相对固定,已经被作为常规手术各地广泛开展。而人工全髋关节置换术后假体发生无菌性松动是它的主要并发症之一,也是比较严重的并发症。对于人工髋关节置换术后假体无菌性松动的治疗,公认的有效治疗措施是髋关节假体翻修手术。但是由于翻修手术不仅手术风险相对较高,而且手术相对复杂,治疗费用昂贵,最重要的是翻修手术术后效果通常并不是特别理想。如果阐明髋关节置换术后假体无菌性松动的病理机制,对预防和治疗假体松动具有重大的意义。目前普遍认为假体无菌性松动发生的主要致病因素为假体磨损颗粒,即“颗粒病理论”。此以外还有多种因素参与无菌性松动的发生,比如假体微动、关节液体压力变化、应力遮挡及内毒素等。虽然无菌性松动发生的诱导因素复杂多样,但无菌性松动的发生根本上是由假体周围骨溶解。研究表明生物型髋关节假体早期的稳定性主要靠假体与骨骼之间的压配,而远期稳定性主要靠假体表面的骨长入。假体植入后多种细胞因子释放,诱导成骨细胞分化成熟。成骨细胞在假体表面形成新的骨组织,从而使假体得到坚强的固定。当假体周围成骨细胞活性被抑制,新骨无法形成于假体表面,破骨细胞活性增强,就会引起髋关节假体周围骨溶解发生,最终引起假体无菌性松动。但是调控成骨细胞活性和成熟的机制复杂多样,如果能明确假体无菌性松动过程中成骨细胞活性和成熟的具体调控机制,则能为无菌松动的预防和治疗提供理论基础。目前研究表明circRNA与骨科多种疾病发生发展有着密切的联系,比如骨关节炎,骨质疏松症等。并且有研究表明circRNA具有调控成骨细胞活性的功能,因此我们推测circRNA与无菌性髋关节假体松动可能出在密切的联系。我们进而对髋关节假体无菌性松动组织进行高通量测序,筛查差异表达circRNAs,并进行相关功能及机制研究。本研由以下三部分构成。第一部分circRNAs在髋关节假体无菌性松动中差异表达情况及ceRNA调控网目的:本研究收集6例髋关节置换术后患者发生无菌性松动的假体周围组织,以及6例初次行人工髋关节置换患者的髋关节滑膜组织。对收集的临床标本进行高通量测序分析,筛选出在无菌性松动组织中表达明显差异的circRNAs。进一步通过qRT-PCR验证确定本研究的目标circRNA,同时构建ceRNA调控轴,为髋关节假体无菌性松动的预防、诊断及治疗寻找新的生物标志物。研究方法:收集临床样本,提取收集的组织中总的RNA,然后进行高通量测序,利用统计学手段对测序产生的数据进一步分析,找出差异表达明显的circRNA。在DAVID网站对差异表达明显的circRNAs的宿主基因和靶基因分别进行功能富集分析,包括GO及KEGG。对差异表达最明显发的10个circRNAs进行qRT-PCR验证,基于Target Scan及miRanda数据库预测目标circRNA的靶向miRNA及mRNA,并构建ceRNA调控轴。结果:我们测序一共筛选出257个circRNAs在无菌性松动组织中表达具有明显差异,表达明显上调的circRNAs共有171个,表达明显下调的circRNAs共有86个。无菌性松动组织中上调的mRNA有1789,下调的mRNA有2142个。KEGG富集分析结果提示差异表达明显的circRNAs宿主基因富集的通路主要是上皮细胞的细菌入侵、肌动蛋白细胞骨架的调控、加压素调节的水重吸收、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白多糖、Rap1信号通路、前列腺癌、自噬、皮质醇合成和分泌、心肌细胞中的肾上腺素能信号通路等。KEGG分析结果显示6个PCR验证阳性的circRNAs的靶基因富集的通路主要是癌症的转录调控失调、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、趋化因子信号通路、自身免疫性甲状腺疾病、toll样受体信号通路、上皮细胞的细菌入侵、原发性免疫缺陷、甲状腺癌、粘附连接、甲状腺激素合成等信号通路。根据qRT-PCR验证结果,我们确定了hsa-circ-0005232为本研究余下部分的目标circRNA,并且进一步构建了hsa-circ-0005232/hsa-miR-21-3p/ULK1调控轴。结论:本研究对全髋关节置换术后假体无菌性松动周围组织及正常组织进行高通量测序,发现257个circRNAs差异表达明显,hsa-circ-0005232在这些circRNA中下调显著,利用生物信息学手段构建了hsa-circ-0005232/hsa-miR-21-3p/ULK1调控轴。本研究的发现有助于无菌性松动发病机制的研究,有助于寻找新的治疗靶点。第二部分hsa-circ-0005232对成骨细胞活性和成熟的调控作用目的:在第一部分中发现hsa-circ-0005232在假体无菌性松动过程中显著下调,并有研究表明hsa-circ-0005232与多种骨病相关。我们通过细胞模型,检测hsa-circ-0005232对成骨细胞活性和成熟的影响。研究方法:首先我们构建高表达和敲低hsa-circ-0005232慢病毒,然后转染人成骨细胞中。采用qRT-PCR方法检测成骨细胞中hsa-circ-0005232及ULK1 mRNA的各自表达情况。通过透射电镜观察成骨细胞自噬体形成情况,通过Western blot检测成骨细胞内LC3 Ⅱ、LC3 Ⅰ及ULK1蛋白表达情况。同时检测成骨细胞成熟的标志蛋白碱性磷酸酶、骨钙素及Ⅰ型胶原的表达情况,以及钙结节的形成情况。结果:当hsa-circ-0005232过表达时ULK1表达相应升高,当hsa-circ-0005232低表达时ULK1表达相应降低。电镜结果显示,过表达hsa-circ-0005232转染的成骨细胞中,自噬体的数目较对照组明显增多,然而敲降hsa-circ-0005232转染后,自噬体的数目与对照组细胞明显减少,我们的实验结果提示hsa-circ-0005232可以显著增加成骨细胞中的自噬体数量。在hsa-circ-0005232过表达组中,LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值明显高于对照组,ULK1蛋白表达量也明显高于对照组。然而,hsa-circ-0005232敲降组与对照组相比LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值降低明显,ULK1蛋白表达与对照组相比也显著降低。与对照组相比碱性磷酸酶在hsa-circ-0005232过表达组中明显升高,而hsa-circ-0005232敲降组中碱性磷酸酶较对照组明显降低。与对照组相比hsa-circ-0005232过表达组中骨钙素分泌量明显升高,而在hsa-circ-0005232敲降组中则明显降低。hsa-circ-0005232过表达组中Ⅰ型胶原含量明显多于对照组,而hsa-circ-0005232敲降组中Ⅰ型胶原含量较对照组明显降低。hsa-circ-0005232过表达组钙结节形成明显多于对照组,而hsa-circ-0005232敲降组的钙结节形成明显低于对照组。以上结果表明hsa-circ-0005232可明显增强成骨细胞的细胞活性和促进成骨细胞的成熟。结论:hsa-circ-0005232能够通过调控ULK1表达影响细胞自噬,从而调控成骨细胞活性和成熟。表明hsa-circ-0005232可通过调控假体表面骨长入,参与无菌性松动发生发展。第三部分hsa-circ-0005232通过竞争性抑制hsa-miR-21-3p调控ULK1的表达目的:我们已经确定hsa-circ-0005232在无菌性髋关节假体松动中明显下调,并构建了hsa-circ-0005232/hsa-miR-21-3p/ULK1调控轴,第二部分研究表明hsa-circ-0005232可以通过ULK1调节自噬影响成骨细胞活性。但hsa-circ-0005232对ULK1的调控机制有待进一步明确。研究方法:我们构建含有hsa-circ-0005232及ULK1与hsa-miR-21-3p结合位点序列的野生型和突变型双荧光素酶报告质粒,然后将以上质粒分别与过表达hsa-miR-21-3p质粒一起到转染到293T细胞中。来验证hsa-circ-0005232与hsa-miR-21-3p的结合性,以及ULK1与hsa-miR-21-3p的结合性。我们构建hsa-circ-0005232及hsa-miR-21-3p过表达慢病毒,转染成骨细胞,qRT-PCR验证靶基因ULK1的表达情况。结果:与其他组相比荧光素酶活性度在hsa-circ-0005232野生型+hsa-miR-21-3p过表达组明显降低,而hsa-circ-0005232突变型+hsa-miR-21-3p过表达共转染组的荧光素酶活性与对照组相比无明显变化。与对照组相比ULK1野生型与hsa-miR-21-3p过表达共转染组荧光素酶活性度显著降低,而对照组相比荧光素酶活性在ULK1突变型和hsa-miR-21-3p过表达共转染组无明显改变。表明hsa-circ-0005232及ULK1均可以与hsa-miR-21-3p直接结合。当hsa-circ-0005232过表达时ULK1 mRNA表达明显升高,而hsa-miR-21-3p过表达时ULK1表达显著降低。而hsa-miR-21-3p对ULK1表达的抑制作用可以被hsa-circ-0005232过表达逆转。表明hsa-circ-0005232是通过竞争性抑制hsa-miR-21-3p间接调控靶基因ULK1的表达。结论:hsa-circ-0005232是通过竞争性抑制hsa-miR-21-3p间接调控靶基因ULK1的表达,发挥ceRNA作用。