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下丘脑是调控生殖和能量代谢的高级中枢,主要由下丘脑背内侧核（dorsal medial hypothalamic nucleus,DMH）、下丘脑腹内侧核（ventromedial hypothalamic nucleus,VMH）、下丘脑室旁核（paraventricular hypothalamic nucleus,PVH）以及弓状核（arcuate nucleus,ARC）区域参与。促性腺激素抑制激素（gonadotropin inhibitory hormone,GnIH）是Tsutsui团队在鹌鹑脑中发现的一种可以抑制促性腺激素释放激素（Gonadotrophin-releasing hormone,GnRH）的新型下丘脑神经肽。同时,在脊椎动物中发现了具有C末端序列Arg-Phe-NH2（RFamide相关肽）的GnIH直系同源物RFRP神经肽,该神经肽主要包括RFRP-1和RFRP-3。在许多哺乳动物中,RFRP-3能够抑制促性腺激素的合成和释放,因此认为RFRP-3是GnIH的功能类似物。GnIH/RFRP-3主要存在于下丘脑背内侧核（DMH）或邻近区域。GnIH有两种受体GPR147和GPR74,其中GPR147是RFRP-3的主要受体且广泛存在于哺乳动物的下丘脑、卵巢、子宫和睾丸等组织中。已证实GnIH可通过下丘脑-垂体-性腺轴与GPR147结合从而抑制GnRH的分泌及黄体生成素（luteinizing hormone,LH）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）的释放,抑制卵巢发育降低雌激素等性激素的合成与分泌,调节神经内分泌系统。蛋白质组学的高速发展给基础医学的研究开辟了新领域,在一定程度上为生命科学指明了探索方向。生物信息学是由生命科学、自然科学和生物学等多学科相结合的新型分析工具,其依赖于计算机对复杂的大数据的处理,来探究一切生物体活动的规律。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,与肺癌和结肠癌并列为全球三大常见癌症之一。研究发现雌激素水平的升高与乳腺癌的发生发展密切相关,其原因可能与下丘脑释放GnRH,刺激FSH和LH的分泌有关。FSH可刺激卵巢卵泡中雌激素的合成,然后作用于下丘脑以诱导LH的产生。LH的急剧升高会触发排卵和黄体发育。绝经后,卵巢产生的雌激素水平可忽略不计。初潮提前和绝经期滞后与乳腺癌的高发风险有关,这突出了性腺激素生成在正常乳腺发育和乳腺癌中的重要性。本课题组前期研究显示,卵巢摘除术补充雌激素（Ovariectomized Estrogen Primed,OEP）大鼠侧脑室微量注射RFRP-3后,可影响GnRH、LH、FSH等激素的释放,但对激素依赖性肿瘤研究较少。促性腺激素对卵巢中雌激素、孕激素等性激素的释放具有调节作用,因此本课题假设侧脑室微量注射RFRP-3后可影响OEP大鼠下丘脑蛋白质的分泌,而下丘脑蛋白质的变化可能影响GnRH的分泌,进一步调节垂体促性腺激素的释放,从而影响下游靶器官的生理或病理变化。本实验通过蛋白质组学结合生物信息学的方法探讨侧脑室微量注射RFRP-3后OEP大鼠下丘脑蛋白质表达的变化,发现差异蛋白主要参与糖酵解等途径。已知糖酵解可以刺激GnRH的释放,故推测糖酵解途径可能是GnIH抑制GnRH释放的机制之一,GnRH可以调节雌激素、孕激素等性腺激素的释放,而雌激素的异常与乳腺癌的发生发展相关。因此本实验假设RFRP-3可能通过此通路调节激素依赖性乳腺癌的发生发展。为验证此假设,本实验用RFRP-3处理人乳腺癌细胞系MCF-7结果显示10000ng/ml的RFRP-3可能通过阻碍PI3K/AKT/mTOR/HIF-1通路抑制糖酵解诱导人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡。第一部分 基于蛋白质组学研究侧脑室微量注射RFRP-3对OEP大鼠下丘脑蛋白质的调节目的:通过蛋白质组学与生物信息学探索侧脑室微量注射RFRP-3对下丘脑蛋白质调节情况。方法:1、选取30只成年雌性SD大鼠,构建卵巢摘除术补充雌激素（ovariectomized estrogen primed,OEP）大鼠模型,随机分为注射RFRP-3实验组和生理盐水对照组,根据《The Rat Brain in stereotaxic coordinates》确定大鼠侧脑室位置,分别注射RFRP-3和生理盐水（16μl/kg,RFRP-3 浓度为 2μg/μl）,每 30 秒注射 0.5μl,于 4min 完成注射。给药6h后取出下丘脑,制备蛋白样品。2、下丘脑蛋白样品酶解,经戴安Dionex ultimate 3000 nano LC system纳升级液相色谱系统进行LC-MS/MS分析。用Maxquant-1.5.2.0算法对肽段进行非标记蛋白质组学定量分析,得到质谱检测的原始数据。3、对质谱原始数据进行GO基因本体分析、KEGG信号通路富集分析和蛋白-蛋白互作分析,筛选差异表达蛋白质和信号通路。4、通过CPTAC和HPA数据库鉴定节点蛋白在肿瘤中的表达及生存分析。结果:1、下丘脑差异蛋白的质谱结果由Uniprot Mouse数据库检索并匹配,共鉴定出253个差异表达蛋白,其中129个蛋白上调,124个蛋白下调。2、GO结果显示,差异蛋白的生物过程（Biological Process,BP）主要在单一生物体和小分子代谢过程中存在富集,细胞成分（Cell Component,CC）差异蛋白主要在细胞质和胞核富集,分子功能（Molecular function,MF）主要体现在与小分子结合的功能上。3、KEGG结果显示,差异蛋白主要参与糖酵解、代谢途径、内分泌等10条重要信号通路（P<0.05）。4、OmicsBean软件可视化蛋白互作网络图（Protein-Protein Interaction,PPI）分析显示:节点蛋白 GALM、ADPGK、PGM1、PFKL为上调,ALDH2为下调蛋白（FC≥2）。5、CPTAC和HPA数据库结果提示节点蛋白GALM（P=0.050）、ADPGK（P=0.0060）、PGM1（P=0.25）、PFKL（P=0.0062）和ALDH2（P=0.0092）在乳腺癌组织及癌旁组织中差异表达及生存分析。第二部分 RFRP-3通过PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α通路抑制糖酵解途径诱导人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡的研究目的:探讨RFRP-3对人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡的影响及作用机制。方法:1、体外培养人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-468,设空白调零组、PBS对照组和RFRP-3实验组（0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml）,CCK-8法确定最佳作用时间和浓度。2、流式细胞术检测人乳腺癌细胞系MCF-7经RFRP-3处理后的凋亡率。3、利用蛋白印迹法（Western Blot）,检测RFRP-3在最佳浓度10μg/ml 时人乳腺癌细胞系 MCF-7 的 ADPGK、Bcl-2、Bax、cytochrome C、Caspase-3、P53、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR、HIF-lα和 G 蛋白偶联受体GPR147的蛋白表达情况。4、使用实时荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）,检测RFRP-3在最佳浓度时人乳腺癌细胞系MCF-7的Bcl-2、Bax、cytochrome C、Caspase-3、P53、PI3K 和 AKT 的 mRNA表达情况。结果:1、各浓度组RFRP-3对人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-468细胞作用情况。人乳腺癌细胞系MCF-7常规培养,设空白调零组、对照组和RFRP-3 实验组（0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml）加入 RFRP-3 作用 24h 和 48h。组间比较,当 RFRP-3作用时间为24h时,药物浓度达到10μg/ml时对MCF-7细胞增殖显著抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。各浓度组RFRP-3对细胞系MDA-MB-453 和 MDA-MB-468 均无影响（P>0.05）。2、对照组与RFRP-3（10μg/ml）实验组细胞凋亡情况。流式细胞仪检测结果:对照组和RFRP-3（10μg/ml）时的细胞凋亡率分别为（7.76±1.57）%、（16.14±3.001）%。对照组与 RFRP-3（10μg/ml）实验组比较细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）。3、RFRP-3 上调 MCF-7 细胞 ADPGK、Bax、Caspase-3、cytochrome C、P53蛋白的表达水平。MCF-7细胞中加入RFRP-3后,与对照组相比,RFRP-3（10μg/ml）实验组 Bax（P<0.01）、Caspase-3（P<0.01）、cytochrome C（P<0.01）和 P53（P<0.05）及关键蛋白 ADPGK（P<0.01）表达水平显著升高,差异有统计学意义（P<0.01）。4、RFRP-3 下调 MCF-7 细胞 Bcl-2、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR、HIF-1α蛋白的表达水平。MCF-7细胞中加入RFRP-3后,对照组和RFRP-3（10μg/ml）实验组组间比较 Bcl-2（P<0.05）、PI3K（P<0.05）、AKT/p-AKT（P<0.01）、mTOR（P<0.05）、HIF-1α（P<0.05）蛋白表达水平显著下降,差异有统计学意义。5、RFRP-3 上调 MCF-7 细胞 Bax、Caspase-3、P53mRNA 的表达水平。在MCF-7细胞中加入RFRP-3后,10μg/ml实验组与对照组相比Bax mRNA表达水平上调（P<0.05）、Caspase-3 mRNA表达水平上调（P<0.01）和TP53 mRNA表达水平显著上调（P<0.05）。6、RFRP-3 下调 MCF-7 细胞 Bcl-2、PI3K 与 AKT 的 mRNA表达水平。在MCF-7细胞中加入RFRP-3后,10μg/ml实验组与对照组相比Bcl-2 mRNA表达水平显著下调（P<0.01）、PI3K mRNA表达水平显著下调（P<0.05）与AKT mRNA表达水平显著下调（P<0.05）。结论:1、侧脑室微量注射RFRP-3,结果显示差异蛋白主要参与糖酵解途径,其中 GALM、ALDH2、ADPGK、PGM1、PFKL 为节点蛋白。2、RFRP-3可能通过GPR147受体诱导乳腺癌细胞MCF-7的凋亡,其凋亡机制可能与阻碍PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α通路抑制糖酵解有关。