植物雌配子体发育是植物进行有性生殖的前提,是形成成熟的雌配子体、完成世代交替所必需的生命过程。雌配子体发育异常往往会导致植株雌性不育,给实际生产带来影响。目前对雌配子体发育的研究主要集中在被子植物上,在裸子植物中尚缺乏深入研究。本课题组在辽宁兴城种子园内发现油松28号天然雌性不育株系,其雌性不育的原因为雌配子体游离核有丝分裂中途停止分裂。本课题组前期的研究发现PtRPL7a(60S核糖体蛋白L7a基因)、PtRab(Rab型小GTP结合蛋白基因)和PtDnaJ(DnaJ-like蛋白基因)在雌配子体发育过程中表达量存在显著性差异,并且通过荧光原位杂交技术证明3个差异基因的表达具有明显的时空特异性。为进一步探究引起雌配子体游离核停止分裂的原因,本论文以辽宁兴城种子园内油松14号可育系和28号不育系胚珠为材料,在前人研究的基础上对可育系与不育系雌配子体发育过程中差异表达的3个基因进行异源表达和生物学功能验证。此外,我们还构建了雌配子体游离核分裂不同时期miRNA数据库,筛选并鉴定了相关miRNA及其靶基因。主要结果如下:1.荧光定量PCR分析显示,PtRPL7a、PtRab和PtDnaJ在油松两系胚珠雌配子体游离核分裂前、中、后期的表达量存在显著差异。PtRPL7a在可育系胚珠的表达量随雌配子体的发育逐渐升高,而在不育系胚珠中其表达量无显著变化;PtRab在可育系胚珠中的表达量随雌配子体的发育逐渐升高,而在不育系胚珠中几乎不表达;PtDnaJ在可育系胚珠的表达量随雌配子体的发育逐渐升高,而在不育系胚珠中其表达量逐渐下降。2.对3个差异基因进行序列分析,构建了进化树,结果表明:3个基因和云杉中的同源基因的序列存在很高的相似性。利用cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplificationofcDNA ends,RACE)扩增得到3个差异基因的编码区,并构建重组质粒进行异源转化拟南芥,对转基因拟南芥植株进行表型和生理生化的分析,进一步探究其功能。结果表明,与野生型拟南芥中同源基因的表达量相比,PtRab基因在拟南芥中的表达水平极低,PtRPL7a和PtDnaJ基因在过表达拟南芥株系中表达量显著提高,差异倍数分别为44.91和99.00。和PtDnaJ基因对拟南芥的营养生长没有产生影响;其对胚囊发育的影响还需进一步观察。3.以雌配子体游离核分裂前期、中期、后期的可育系和不育系油松胚珠为材料,利用小RNA深度测序技术系统地研究雌配子体发育过程中具有显著性表达差异的miRNAs。研究结果表明,利用Solexa高通量测序技术共构建了 18个小RNA文库,共获得257,597,230条高质量序列。通过Blast和Patmatch软件分析,发现了 530个已知miRNA基因家族和899个新的miRNA。通过进一步数据分析,发现在可育系与不育系胚珠中表达量存在显著差异的已知miRNA为20个,对其靶基因进行GO功能注释和KEGG通路分析,发现靶基因主要富集在细胞过程、信号转导、代谢等生物过程,植物激素信号转导和内呑作用等通路。4.荧光实时定量 PCR 实验验证了 miR160-x、miR390-x、miR8569-y 和 miR156-x这4个miRNAs和其对应的5个靶基因在可育系和不育系胚珠中雌配子体发育过程中的表达水平,结果表明:4个miRNAs在可育系胚珠的表达量均高于不育系胚珠,miR160-x在可育系胚珠的表达量随雌配子体的发育逐渐下降,而在不育系胚珠中其表达量逐渐升高;miR390-x、miR8569-y和miR156-x在可育系胚珠的游离核分裂中期表达量最高,miR390-x在不育系胚珠中其表达量逐渐升高,miR8569-y和miR156-x在不育系胚珠中其表达量逐渐下降。除HIPP26外,其余的miRNA和其靶基因均为负调控关系。荧光定量PCR的结果与测序结果一致,表明sRNA测序和转录组测序能有效的分析miRNA和其靶基因的表达模式。综上所述,本研究对油松雌配子体发育的3个差异基因进行深入研究,发现其表达量在可育系和不育系胚珠中存在显著差异;对3个过表达拟南芥植株进行生物学功能分析,发现PtRPL7a、PtRab和PtDnaJ基因对拟南芥的营养生长没有产生影响。此外,我们还系统地研究和鉴定油松雌配子体发育过程中的miRNAs及其调控的靶基因,并初步阐述了关键miRNAs的表达模式和生物学功能,为研究miRNAs在转录水平调控雌配子体游离核分裂提供了新的思路,并丰富了木本植物发育生物学理论的研究。