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有研究表明表观遗传调控在促进和维持肿瘤干细胞(CSC)特性中发挥重要作用。然而,在肝细胞癌(HCC)中,促进肝癌干细胞(LCSCs)特性的表观遗传调控机制以及靶向表观遗传调控的药物作用机制尚未完全阐明。本文的预实验结果表明,SMMC-7721细胞系LCSCs较亲本细胞有更高DNMT1活性,更低miR-34a-5p表达。此外,抗肿瘤活性药效学筛选实验发现蔓荆子总黄酮(FVTF)有效抑制LCSCs球形成和DNMT1活性,上调miR-34a-5p水平。计算机模拟发现miR-34a-5p与FoxM1 3′端非翻译区有特异结合位点。据此,我们假设:DNMT1/miR-34a-5p/FoxM1信号轴在促进LCSCs特性中起重要作用;同时,FVTF通过抑制DNMT1活性和表达、上调miR-34a-5p表达、直接靶向抑制FoxM1,从而抑制LCSCs特性。为了验证该科学假设,本研究以SMMC-7721细胞系CD133~+肝癌球细胞作为LCSCs模型。分别应用ELISA、蛋白质印迹、定量逆转录PCR(qRT-PCR)和甲基化特异性PCR(MSP)比较SMMC-7721细胞与LCSCs DNMT1活性以及蛋白和mRNA表达、miR-34a-5p表达及其启动子甲基化水平。分别用球形成法、琼脂集落形成法、流式细胞术分析、蛋白质印迹法和qRT-PCR检测SMMC-7721细胞与LCSCs的肝癌球形成率、集落形成率、CD133阳性细胞百分率、CSCs标志物(CD133、CD44和ALDH1)以及多能性转录因子(Bmi1、Sox2和Oct4)蛋白和(或)mRNA表达水平;以体外评价LCSCs特性。通过测定LCSCs裸鼠移植瘤生长速率和CD133及CD44蛋白表达,以体内评价LCSCs特性。利用地西他滨(DAC)和DNMT1 shRNA或DNMT1cDNA等抑制或过表达DNMT1基因确定DNMT1组成性活化促进LCSCs特性以及抑制DNMT1介导FVTF抑制LCSCs特性作用。分别采用miR-34a-5p模拟物和抑制物鉴定低表达miR-34a-5p促进LCSCs特性以及上调miR-34a-5p介导FVTF抑制LCSCs特性作用。分别使用荧光素酶报告基因、FoxM1敲低或过表达、DAC或硫链丝菌素(THI)处理鉴别miR-34a-5p靶基因FoxM1和FoxM1过表达促进LCSCs特性以及FVTF通过下调FoxM1表达抑制LCSCs特性。在拓展性研究中,MHCC97H细胞系肝癌球细胞用作肝癌干细胞样细胞(LCSLCs);并明确DNMT1/miR-34a-5p/FoxM1信号轴在MHCC97H细胞系LCSLCs的表型和功能以及FVTF的药理作用。基于TCGA和GEO数据库肝细胞癌队列的生物信息学分析,以评价DNMT1/miR-34a-5p/FoxM1信号轴在肝细胞癌发生和肝细胞癌病人预后中的作用。结果表明,SMMC-7721细胞系LCSCs展示出DNMT1活性和表达增高、miR-34a-5p表达降低、体外LCSCs特性增强以及裸鼠皮下移植瘤生长速率加快。DAC处理和敲低DNMT1有效的抑制LCSCs DNMT1活性和表达、上调miR-34a-5p表达、降低miR-34a启动子甲基化水平和减弱体外LCSCs特性;同时,抑制LCSCs裸鼠移植瘤生长。过表达DNMT1增强亲本细胞DNMT1活性和表达、下调miR-34a-5p表达、增高miR-34a-5p启动子甲基化水平和增强体外LCSCs特性。miR-34a-5p模拟物上调LCSCs miR-34a-5p表达和减弱体外LCSCs特性,抑制裸鼠移植瘤生长。miR-34a-5p抑制物能降低亲本细胞miR-34a-5p表达和增强体外LCSCs特性,但是,miR-34a-5p模拟物或抑制物均不影响DNMT1活性及蛋白和mRNA表达。此外,miR-34a模拟物救援过表达DNMT1抑制miR-34a-5p表达和增强体外LCSCs特性作用。荧光素酶报告基因试验证实FoxM1是miR-34a-5p的靶基因;FoxM1敲低或过表达能模拟或拮抗miR-34a-5p抑制LCSCs特性作用。FVTF以浓度依赖方式抑制LCSCs DNMT1活性和mRNA表达、上调miR-34a-5p表达、降低miR-34a-5p启动子甲基化水平、下调FoxM1表达和减弱体外LCSCs特性;同时,抑制裸鼠移植瘤生长。DAC、miR-34a-5p模拟物、THI协作FVTF抑制LCSCs特性,并分别表现出协作FVTF抑制DNMT1活性和表达、上调miR-34a-5p表达以及下调FoxM1表达作用。过表达DNMT1、miR-34a抑制物或过表达FoxM1能减弱FVTF抑制LCSCs特性作用,同时,分别展示出拮抗FVTF抑制DNMT1活性和表达、上调miR-34a-5p表达以及下调FoxM1表达作用。然而,变动FoxM1表达水平不影响FVTF调节DNMT1活性和表达以及miR-34a-5p表达作用;改变miR-34a-5p表达对FVTF抑制DNMT1活性和表达作用无明显影响。此外,MHCC97H细胞系LCSLCs呈现出DNMT1活化、miR-34a-5p低表达、FoxM1过表达和LCSLCs特性增强等表型;FVTF能有效地减弱上述表型。源自TCGA和GEO数据库的肝癌队列数据分析证实DNMT1和FoxM1在肝细胞癌组织高表达,而miR-34a-5p呈现出低表达;DNMT1和FoxM1正相关,而两者与miR-34a-5p负相关;且与肝细胞癌患者预后不良有关。整合上述结果,可以得出如下结论:1.组成性活化DNMT1表观沉默miR-34a-5p去抑制激活FoxM1在LCSCs特性的促进和维持中起重要作用。2.FVTF具有抑制LCSCs特性作用;其作用分子机制涉及抑制DNMT1活性和表达、上调miR-34a-5p表达,靶向下调FoxM1表达。