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目的表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)具有加速皮肤角质细胞的迁移、分化和增殖作用,现已广泛的用于各种化妆品中。然而,由于皮肤的屏障作用,化妆品中的EGF几乎不能经皮渗透进入皮肤。本文旨在研究通过微针技术,提高EGF透皮吸收量,从而发挥生理和药理作用,同时也为其他大分子药物经皮渗透提供实用方法。材料和方法1、剃除SD大鼠背部毛发后,肉眼观察剃毛后皮肤出血情况及皮下组织修剪前后情况。取下SD大鼠皮肤后行HE染色,组织学观察皮下组织修剪前后皮肤角质层完整性和修剪层次和微针针刺后的针刺深度。2、采用改良的Franz扩散池进行大鼠离体皮肤渗透试验,分为5组:生理盐水组、10.0mg/L rh EGF组、微针+1.0mg/L rh EGF组、微针+10.0mg/L rh EGF组、微针+20.0mg/L rh EGF组。用rh EGF ELISA KIT法测定接受液中EGF的含量,分别计算出在涂药后的0.5h、1h、2h、4h、6h和8h的药物累积渗透量和累积渗透率,确认使用微针后rh EGF获得了良好的渗透效果。3、SD大鼠处理操作:取3只体重约200±30g的大鼠,备皮后饲养24h,腹腔注射水合氯醛(0.003m L·g-1)麻醉。于大鼠脊柱两侧对称部位画直径约1.50cm的圆圈,左右各三个,使用微针阵列以约5N压力(与人手指按压力度相当)刺入皮肤。4、龙胆紫染色、大体和组织学观察:SD大鼠按操作3处理后,用龙胆紫染色,拍摄照相,肉眼观察并记录皮肤有无红斑及水肿出现以及角质层恢复情况。切取全层皮肤行HE染色,观察组织学变化。5、钙黄绿素染色实验:大鼠按操作3处理后,用钙黄绿素棉球覆盖,避光染色10min,取开棉球,用盐水和酒精棉球交替擦拭各2遍,取全层皮肤稍微修剪皮下组织后置于载玻片,立即在荧光显微镜下观察,激发波长490nm,发射波长515nm,统计光斑数,获取荧光图像。6、取10只已备皮的SD大鼠,体重约200±30g,分2组,每组5只,按操作3处理。待完全麻醉后进行标记,第一组为10.0mg/L rh EGF组,左侧由头侧向尾侧标记为0.5h、1h、2h,右侧从头到尾标记为4h、6h、8h,直接皮肤给药至指定时间点后切取皮肤全层及皮下肉膜均浆。第二组为微针+10.0mg/L rh EGF组,左侧由头侧向尾侧标记为0.5h、1h、2h,右侧从头到尾标记为4h、6h、8h。微针5N压力后,立即外用10.0mg/L rh EGF直至指定时间,取涂抹部位皮肤全层,将全层皮肤和皮下肉膜层分开,分别匀浆,采用rh EGF ELISA KIT测定各组皮肤及皮下肉膜rh EGF浓度。7、皮肤和肉膜中EGF含量分别用x±s表示。采用统计学软件SPSS19.0进行统计学分析。多个实验组样本均数两两之间的全面比较用SNK-q检验(n=5),P<0.05为差异有显著性。结果1、大鼠脊柱两侧毛发剃除干净,未见伤痕及出血点,饲养24h后,角质层完好无损,皮肤屏障结构健全。修剪后完整保留真皮层,未见皮下肌肉及脂肪组织。微针阵列针刺大鼠皮肤后,角质层被破坏,微针刺入深度达真皮浅层。随着时间推进,大鼠皮肤逐渐愈合,于12h~16h皮肤基本愈合,角质层完整性恢复。2、微针+rh EGF组较rh EGF组获得了良好的透皮效果。在给药0.5h后生理盐水组可测得微量EGF,说明鼠皮内正常存在EGF。各时间点10.0mg/L rh EGF组、微针+1.0mg/L rh EGF组、微针+10.0mg/L rh EGF组、微针+20.0mg/L rh EGF组与生理盐水组比较均可测得rh EGF透过,P<0.05。生理盐水组、10.0mg/L rh EGF组、微针+1.0mg/L rh EGF组、微针+10.0mg/L rh EGF组、微针+20.0mg/L rh EGF组随着时间迁移rh EGF较上一时间点透过量增加,P<0.05。微针+10.0mg/L rh EGF组较10.0mg/L rh EGF组获得了良好的透皮效果,微针+10.0mg/L rh EGF组2h、4h、6h、8h透过量分别为10.0mg/L rh EGF组的9.485、19.989、12.768、6.994倍(P<0.05)。微针+10.0mg/L+rh EGF组、微针+20.0mg/L rh EGF组在2~4h单位时间透皮量和单位时间透皮率达到峰值,各组累积透皮量和累积透皮率随时间延长缓慢增加。各组8h累积透皮率小于均1%。3、微针针刺后8h仍可见有龙胆紫残留于角质层上,16h后基本不见龙胆紫残留。推测微孔愈合时间在8~16h。4、钙黄绿素染色:微针处理皮肤微孔愈合过程中,钙黄绿素透过量减少,荧光光斑变小,12h时微弱可见,16h观察不到荧光光斑。5、创伤愈合组织学观察:滚轮微针处理后皮肤屏障破坏,深达真皮浅层,随着时间的延长,微孔收缩,尺寸变小。到16h,微孔被增生的表皮细胞覆盖,皮肤屏障结构基本恢复。6、微针+10.0mg/L组及10.0mg/L组在2h、4h、6h、8h皮肤组织中EGF含量较正常皮肤均增加(P<0.05)。微针+10.0mg/L组及10.0mg/L组在4h后皮肤EGF含量均达到峰值,为正常皮肤的1.92倍(P>0.05)。7、10.0mg/L rh EGF组、微针+10.0mg/L rh EGF组大部分时间点肉膜EGF含量高于正常皮肤(P<0.05)。微针+10.0mg/L rh EGF组肉膜各个时间点EGF含量均高于10.0mg/L rh EGF组肉膜(P<0.05)。结论1、微针+rh EGF组较rh EGF组和生理盐水组获得了良好的透皮效果,但8h累积渗透量仍小于1%。2、微针所致微创伤在12~16h内愈合,皮肤屏障功能恢复。3、微针+10.0mg/L组及10.0mg/L组在2h、4h、6h、8h皮肤组织中EGF含量较正常皮肤增加,且达到了发挥EGF生理效用的浓度。