细胞骨架包括微管、微丝和中间丝,其中细胞微管骨架是细胞内的高效运输系统,可被入侵的病毒所劫持,从而将由基因组与蛋白质组成的复合物运输到复制位点,有利于病毒自身的复制。宿主细胞骨架微管蛋白的结构和功能影响病毒感染过程及复制能力。微管蛋白转录翻译后修饰调节可以影响微管的功能,α-tubulin乙酰化修饰水平可以作为神经细胞微管稳定性的标志。本课题组前期研究发现,细胞肌动蛋白丝骨架通过促进cofilin磷酸化参与猪血凝性脑脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV）高效入侵神经细胞过程,并且PHEV穿透细胞膜后又激活cofilin调节应力纤维形成进而促进病毒的胞内运输,但细胞骨架微管蛋白在该病毒感染过程中的功能及相关机制尚不清楚。为了阐明PHEV诱导神经细胞微管蛋白损伤的特点,揭示微管蛋白α-tubulin修饰作用对PHEV感染的影响,本文开展了系统的研究工作。将PHEV感染小鼠神经瘤母（Neuro-2a,N2a）细胞,利用间接免疫荧光技术检测表明,PHEV感染过程中N2a细胞骨架结构发生重排,伴随着微管组织中心（MTOC）的消失,且微管蛋白（α-tubulin）乙酰化修饰作用显著降低。Western blot检测可见PHEV感染的N2a细胞中α-tubulin乙酰化水平呈时间依赖性下调,表明PHEV感染诱导微管结构解聚。为明确宿主细胞微管稳定性是否与PHEV复制能力有关,本研究选取微管解聚药物诺考达唑（Noco）以及微管结构稳定药物紫杉醇（Taxol）分别对N2a细胞进行干预。通过Western blot、q PCR及病毒滴度检测发现,N2a细胞微管解聚会使PHEV m RNA、PHEV-N蛋白表达量明显下降,免疫荧光技术检测可见细胞内病毒粒子荧光信号强度下降,提示N2a细胞骨架微管蛋白解聚抑制PHEV复制。然而,药物诱导的微管高度聚合对PHEV感染并无明显影响。组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）是调控微管稳定性的主要蛋白酶,为进一步研究细胞微管影响PHEV复制的机制,本研究利用q PCR检测发现PHEV感染诱导N2a细胞内HDAC6表达水平呈时间依赖性升高,提示PHEV感染使神经细胞微管蛋白乙酰化下调。为明确HDAC6活性是否会对PHEV感染具有一定影响,首先利用si RNA技术敲除N2a细胞中HDAC6基因,Western blot检测发现与神经细胞微管稳定性密切相关的α-tubulin的乙酰化水平上调。另外,选用曲古菌素A（TSA）抑制去乙酰酶HDAC6活性,经免疫荧光染色、Western blot、q PCR等检测表明,抑制HDAC6活性可使底物α-tubulin乙酰化水平明显升高,并且微管结构聚合能力增强,但不影响PHEV复制。综上研究证明,PHEV感染诱导N2a细胞的微管解聚,微管稳定性下降抑制PHEV复制,但该过程不依赖于HDAC6对α-tubulin骨架的去乙酰化作用。该项研究成果,初步阐明了PHEV感染致神经细胞微管结构重排的机制,不仅为嗜神经型冠状病毒PHEV的致病机制解析奠定了基础,而且可为以微管作为抗病毒靶标药物的筛选提供理论依据。