结直肠癌（CRC）是全球排名第三的常见恶性肿瘤,病死率较高,在早期结直肠癌临床症状并不明显,使得发现时常是中晚期,晚期结肠癌治疗的基本手段是手术联合放化疗,副作用大,给患者带来较大痛苦,因此,针对结直肠癌疾病防治,寻找一种对机体更加安全、毒副作用小的治疗药物有重要价值。生物多糖正是当前抗肿瘤药物的研究热点,真菌多糖发挥其抗肿瘤作用机制通常是通过靶向调节细胞凋亡和增殖相关信号通路,从而起到抑制肿瘤组织恶性增殖的作用,引发细胞凋亡,并且其对正常细胞没有毒副作用,从而为靶向肿瘤治疗提供了新思路。本课题组前期,在黑根霉（Rhizopus nigricans）发酵液中提取分离得到分子量为9682Da的活性多糖,命名为黑根霉胞外多糖（Exopolysaccharides 1-1）,已证明其可诱导小鼠结直肠癌细胞CT26和人结肠癌细胞HCT116凋亡,抑制氧化氮甲烷/硫酸葡聚糖（AOM/DSS）诱导的小鼠结直肠癌的发生发展。并且,EPS1-1能够通过多种促凋亡、抑生长的信号通路诱导CT26细胞凋亡。但是对其机制的研究仍不完善,本文拟从蛋白水平全面研究EPS1-1诱导CT26细胞凋亡凋亡的机制。在宏观蛋白水平上,利用TMT蛋白质组学技术分析了 EPS1-1对于结直肠癌细胞的蛋白表达量变化情况,系统掌握了 EPS1-1诱导CT26细胞凋亡的差异蛋白表达情况。通过对EPS1-1处理组和KB组质谱数据进行检索,以1.3倍、0.8倍差异倍数为阙值,64个蛋白表达量显著上调,68个蛋白表达量显著下调。通过差异蛋白GO功能注释分析以及KEGG信号通路富集分析表明,差异蛋白主要集中在细胞生长和死亡、细胞粘附、免疫反应等相关通路上,其中经典的外源性死亡受体通路中差异蛋白数较多,并且Hippo信号通路中关键蛋白在EPS1-1处理后变化显著,因此,实验后续深入研究了这几条相关通路在EPS1-1诱导CT26细胞凋亡中的影响。首先深入分析了 EPS1-1通过Hippo信号通路调节CT26细胞凋亡的作用,Western-blot检测显示,当EPS1-1浓度为0.6 mg/ml时,Hippo通路关键蛋白YAP1（Yes-associated protein 1,YAP1）表达量显著下调,磷酸化程度明显上调,关键激酶SAV1与MST1表达明显上调,磷酸化的LATS1显著上调,为进一步研究其作用机制,用XMU-MP-1（Hippo信号通路抑制剂）处理CT26细胞5 h后,再加入0.6 mg/ml的EPS1-1处理24 h,Western-blot检测表明,EPS1-1处理后与XMU-MP-1处理组中空白组相比,Hippo信号通路中关键蛋白YAP、MST1等变化不显著,说明抑制剂抑制了 MST1的表达,阻断了 Hippo信号通路的激活。MTT法检测细胞活力,结果表明与空白组相比,XMU-MP-1的加入使得细胞活力上升,但并不显著,而与EPS1-1组相比,XMU-MP-1的加入使得CT26细胞的活力显著上升到89.6%。综上结果表明Hippo信号通路抑制剂的加入减弱了EPS1-1诱导CT26细胞凋亡的作用。进一步研究发现,EPS1-1能够激活CT26细胞内死亡受体途径。当EPS1-1浓度为0.6 mg/ml,处理时间为24 h时,死亡受体通路关键蛋白Caspase3/8被激活,FAS蛋白表达显著上调;qPCR检测表明,当0.4 mg/ml EPS1-1处理CT26细胞24 h时,死亡受体通路中Caspase3/8和FAS相关基因上调最显著,说明EPS1-1可以调节死亡受体通路相关基因和蛋白的表达,从而引发细胞凋亡。最后,以结肠癌组织为材料,研究了 EPS1-1对Hippo信号通路以及死亡受体通路的调节作用。氧化偶氮甲烷/硫酸葡聚糖（AOM/DSS）诱导建立小鼠结肠癌模型,取出完整结肠,石蜡包埋后保存备用。免疫组化检测显示,FADD、Caspase8蛋白在模型组较对照组低表达,而EPS1-1处理组较对照组中FADD,Caspase8表达均显著上调,说明在体内EPS1-1能够通过蛋白水平调节死亡受体信号通路;另外SAV1和MST1在EPS1-1处理组中阳性率较对照组显著提高,并且对照组中YAP蛋白表达量较模型组较低且大部分在细胞核,EPS1-1处理组染色部位基本在细胞质,染色强度较浅,说明EPS1-1的加入使得SAV等激酶表达提高,最终磷酸化YAP蛋白,使其不能进核,与细胞增殖相关的基因无法转录,最终抑制组织生长。这些结果说明EPS1-1在结直肠癌组织中,通过调节Hippo信号以及死亡受体信号通路关键蛋白,共同抑制结肠癌的发生发展。