一、研究背景和目的肠出血性大肠埃希菌（Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC）O157:H7是一种新现肠道致病菌,能引起人出血性肠炎（Hemorrhagic colitis,HC）、溶血性尿毒综合征（Hemolytic uremic syndrome,HUS）和血栓性血小板减少性紫癜（Thromboticthromobocytopenie porpura,TTP）等。1982年在美国密执安州和俄勒冈州,Riley等报道了因食汉堡包引起的食物中毒事件,最后确认病原菌是EHEC O157:H7。随后世界各地均有发生EHEC O157:H7流行。美国于1993年发生了一次涉及到4个州700余名儿童的EHEC O157:H7暴发,其中51例发生了HUS,4例死亡。1996年5-8月在日本发生了一起涉及30多个县市的的EHEC O157:H7暴发流行,患者9000余名,死亡9人。1999-2000年我国苏皖等地发生的EHEC O157:H7大规模暴发流行,患者约2万人,发生急性肾功能衰竭者195人,死亡人数177人,可能是迄今为止世界上流行规模最大、死亡人数最多、流行时间最长、发病原因最复杂的一次。EHEC O157:H7的感染呈暴发流行趋势,具有强烈的致病性与致死性,已成为全球性的公共卫生问题。EHEC O157:H7致病性相关的毒力因子有紧密黏附素（Intimin）、志贺毒素1型、2型（Shiga toxin,Stx 1、Stx 2）和溶血素（Haemolysin,Hly）等。EHEC O157:H7的致病作用主要通过细菌对肠黏膜上皮细胞黏附和产生毒素两个过程。EHECO157:H7侵入机体后,通过菌毛局限性地黏附在盲肠和结肠上皮细胞的刷状缘上并损害微绒毛,此后细菌染色体LEE（LOCUS of enterocyte effacement）毒力岛上的eae基因编码的Intimin介导细菌紧密黏附在肠上皮细胞膜上,导致在肠上皮细胞与细菌接触处的邻近部位肌动蛋白和肌球蛋白等积聚,形成垫状结构,这种损害被称为黏附—抹去（Attaching and effacing lesion,A/E lesion）损伤。在EHECO157:H7特征性A/E损伤的发生过程中,Intimin起非常重要的作用,有研究表明Intimin是EHEC O157:H7在人肠道粘膜定居并引起A/E损伤所必需。Tzipoai等使染色体上eae基因突变致EHEC O157:H7不能黏附到上皮细胞,当eae基因用质粒载入后,细菌的黏附能力随即得到恢复,从而进一步证实了Intimin与致病能力的关系。长期以来,很多研究人员对EHEC O157:H7 Intimin黏附肠上皮细胞及在人和动物肠道定居过程中所起的作用进行了不断探索。研究结果显示,Intimin是EHEC O157:H7向人类肠上皮细胞黏附及在动物肠道中形成A/E损伤所必需的毒力蛋白。McKee等发现在其N-末端切除1/3的区域,Intimin仍表现出相同的活性,Intimin真核细胞结合结构域位于多肽链C-末端的280个氨基酸内（Int280）。Adu-Bobie等对Int280进行分析,发现Intimin至少有α、β、γ、δ等四个亚型,Oswald等在人和牛的EHEC菌株中发现Intimin的第五个亚型Intiminε。EHEC O157:H7的Intimin属于γ型,由934个氨基酸组成,其活性定位在Int280。目前发现3种大肠杆菌O157:H7 Intimin受体:细菌自身编码的Tir、核仁素和β1整合素。2002年,Sinclair等发现表达在Hep-2细胞表面的核仁素也是EHEC O157:H7 Intiminγ的受体。本研究试图对eae基因进行克隆与表达,纯化得到重组蛋白Intimin,利用Western blot检测其免疫反应性,细胞免疫荧光技术检测Intimin对Hep-2细胞的黏附作用,证明Intimin可以黏附于Hep-2细胞表面,推测该作用应该是通过膜表面受体介导的。为后序进行膜受体纯化、最终阐明Intimin参与的相关致病机制奠定基础。二、研究方法1.EHEC O157:H7 eae基因重组表达质粒的构建依GenBank上公布的eae基因核苷酸序列（accession number:z11541）,运用Primer5.0、DNAMAN设计引物1、2,上游引物P1为5’GGTGGTCA TATGATTACTCATGGTTGTTAT3′（NdeⅠ）;下游引物P2为5’CCGTC TCGAGTTCTACACAAACCGCATAG3′（XhoⅠ）。以EHEC O157:H7全菌作为模板,经PCR扩增出eae基因,再将eae基因克隆至pMD19-T,构建出克隆重组质粒pMD19T-eae,利用三酶切（ScaⅠ、NdeⅠ和XhoⅠ）从克隆重组质粒上回收eae基因片段,然后与经NdeⅠ和XhoⅠ酶切的表达载体pET-28a（+）连接,构建出重组表达质粒pET-28a（+）-eae,并转化至E.coli BL21（DE3）。2.EHEC O157:H7紧密黏附素的表达与纯化对转化的宿主菌E.coliBL21（DE3）进行诱导表达,综合考虑Intimin的表达量和表达外源蛋白对宿主菌的不利影响,对诱导表达条件进行分组优化:诱导温度分为30℃和37℃两组,IPTG终浓度分为0.0、0.1、0.5、1.0、2.0和3.0mmol/L共6组,诱导时间分为0、1、2、4和6h共5组,根据优化结果确定最适蛋白表达条件。超声破菌鉴定Intimin在大肠杆菌中表达方式。8M尿素溶解包涵体,利用重组蛋白Intimin上的His·Tag与Ni²⁺-NTA琼脂糖凝胶柱作用进行亲和层析,改变咪唑浓度纯化出Intimin,尿素按8M、4M、0M的递降梯度在4℃条件下对其透析复性48h。3.EHEC O157:H7紧密黏附素功能的初步研究用兔抗EHEC O157:H7多抗血清作为一抗对纯化后的Intimin进行Western blot检测;细胞免疫荧光技术检测Intimin对Hep-2细胞的作用,对Intimin孵育浓度进行分组:5、10、20μg/ml,共3组。用小鼠Anti-His作为一抗、羊抗鼠IgG-Alexa Fluor 546作为二抗,观察黏附在Hep-2细胞上的红色荧光情况。三、结果1.构建了EHEC O157:H7重组表达质粒pET-28a（+）-eae用EHECO157:H7全菌作为模板,PCR扩增出了大小约2805bp的eae基因,经T-A克隆构建出重组克隆质粒pMD19T-eae,测序BLAST比对分析,与GenBank上公布的eae基因序列（accession number:z11541）有99%的同源性,有9个碱基发生突变,分别在208、670、731、942、945、961、1352、1935、2392处,对应氨基酸突变位点分别为241、312、313,其余为同义突变。由于Intimin结构域位于C-末端280个氨基酸内,突变位置远离结构域,对Intimin功能影响不大;另外,EHEC O157:H7菌株之间存在差异,本研究用的是广州菌株,而比对时是与标准菌株序列进行比对,所以序列同源性就可能达不到100%。三酶切（ScaⅠ、NdeⅠ和XhoⅠ）重组克隆质粒pMD19T-eae回收得到eae基因,再与pET-28a（+）连接,转化至E.coli BL21（DE3）中构建出重组表达质粒pET-28a（+）一eae,测序结果与前面一致。2.表达并纯化出EHEC O157:H7紧密黏附素诱导表达获得相对分子质量（Mr）约97kDa的蛋白条带,结果与预期一致。通过对表达条件的优化,确定最适诱导eae基因表达Intimin的条件是IPTG终浓度1.0 mmol/L、37℃诱导表达4h。超声破菌显示Intimin以包涵体形式存在于沉淀中。8M尿素溶解包涵体,Ni²⁺-NTA琼脂糖凝胶柱进行亲和层析,通过改变咪唑浓度纯化出Intimin,长时间（48h）、低温（4℃）、尿素缓慢递减（8M、4M、0M）透析对其复性,将纯化后的Intimin以1mg/ml的浓度分装、冻存于-70℃冰箱。3.初步研究了EHEC O157:H7紧密黏附素功能Western blot检测,得到一条Mr约97kDa的特异性条带,即重组蛋白Intimin。Intimin与Hep-2细胞的细胞免疫荧光实验中可见:Hep-2细胞膜有明显红色荧光出现,而细胞内未见明显红色荧光,Intimin结合在Hep-2细胞表面;随Intimin孵育浓度增加荧光染色逐渐明显,在10μg/ml时、细胞形态维持好、膜染色清晰。四、结论本研究用EHEC O157:H7全菌作为模板,PCR扩增出编码Intimin的全长eae基因,T-A克隆构建了重组克隆质粒pMD19T-eae并测序分析,BLAST比对,与GenBank上公布的eae基因序列（accession number:z11541）有99%的同源性。据分析,有9个碱基发生突变,对应氨基酸突变位点分别为241、312、313,由于Intimin结构域位于C-末端280个氨基酸内,突变位置远离结构域,对Intimin功能影响不大;另外,EHEC O157:H7菌株之间存在差异,本研究用的是广州菌株,而比对时是与标准菌株序列进行比对,所以序列同源性就可能达不到100%。三酶切（ScaⅠ、NdeⅠ和XhoⅠ）回收得到eae基因,再通过连接、转化、筛选出重组表达质粒pET-28a（+）-eae。通过对诱导温度、时间和IPTG浓度的优化,确定在E.coli BL21（DE3）中诱导eae表达Intimin的合适条件:IPTG终浓度1.0 mmol/L,37℃诱导表达4h。超声破菌鉴定出Intimin是以包涵体形式表达。包涵体经尿素溶解后,用Ni²⁺-NTA-琼脂糖凝胶柱对其进行亲和层析,纯化出Intimin,梯度减低尿素浓度充分复性得到纯化的重组蛋白Intimin。Western blot检测出Intimin对兔抗EHEC O157:H7多抗血清具有良好的免疫反应性。Intimin与Hep-2细胞的细胞免疫荧光实验中可见:Hep-2细胞膜有明显红色荧光出现,而细胞内未见明显红色荧光;当Intimin孵育浓度为10μg/ml时,细胞形态维持好、膜染色清晰。证明了Intimin具有黏附真核细胞Hep-2细胞的功能,推测其黏附作用应该是通过膜表面受体介导的,为后序进行膜受体纯化、最终阐明Intimin参与的相关致病机制奠定基础。